斑点杂交条件的建立及优化论文

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1、斑点杂交条件的建立及优化论文.freelentandoptimizationofthedotblotprerequisite【Abstract】ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.Methods13正向、反向引物进行克隆PCR，M13ForM的EDTA对比稀释，使成0.4NNaOH和10mM的EDTA的终浓度。(2)把稀释的pp-GalNAcT2的cDNA片段在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(3)膜（购自Amers

2、co公司，带正电荷）用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干。(4)每点2μl把pp-GalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯下照2min，取出让膜干燥。(5)杂交时以2×SSC浸膜5min，装入杂交袋，根据VECTORNIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42℃。以每100cm2膜加20ml的预杂交液（50％的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，用pH7.5的PB调终体积）于42℃预杂交2～3h。(6)弃去预杂交液，在杂交液（50％的去离子甲酰胺

3、，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，10％的硫酸葡聚糖，100μg/ml的剪切的鲑鱼精DNA，用水调终体积）中加入适量探针，以每100cm2膜加10ml的杂交液于42℃杂交过夜。(7)用足量洗涤液1（2×SSC，0.1%SDS）于42℃洗涤2次，再用洗涤液2（0.5×SSC，0.1%SDS）于55℃严谨洗涤2次。(8)用蒸馏水淋洗膜2～5min，然后用封闭液（不同浓度的BSA，0.1MNaCl，0.2%Triton-100，0.1MTris，pH7.5）封闭。(9)倒出封闭液

4、，加入用封闭液配制的适当比例稀释的卵白素-碱性磷酸酶（购自上海华舜生物工程有限公司），37℃孵育30min。(10)洗涤液3（0.1MTris，0.15MNaCl，0.3%Tl检测缓冲液加66μlNBT和11μlBCIP(均购自上海华舜生物工程有限公司)的显色液显色。(11)显色结束后以TE终止，用扫描仪获取图像。1.2.2斑点杂交建立及优化程序(1)尼龙膜上不点任何样品，以下述条件行假杂交反应。杂交液中探针的终浓度为：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml；酶的稀释比例为

5、：1／400、1／800、1／2000、1／5000；封闭液中BSA的终浓度为：2％，封闭2h；杂交后洗涤液1和2分别洗2次，每次1h；封闭后洗涤液洗2次，每次1h；检测缓冲液平衡1h；显色30min。（2）以（1）所获得的最佳本底，在尼龙膜上点上pp-GalNAcT2的cDNA片段，其余条件不变，封闭液中BSA的浓度设计成2％、3％和5％三梯度进行杂交反应（3）以（2）所获得的最佳条件，改进以下条件：①杂交后洗涤时间每次1h;每次30min；每次10min；②封闭液封闭时间2h;1.5h;50min

6、；③封闭后洗涤时间由每次1h;每次40min;每次20min；④检测缓冲液平衡时间由1h；30min;10min；⑤显色以出现清晰的阳性信号，本底最低为尺度，一般在15min左右，时间延长本底升高。1.3斑点杂交法检测K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株pp-GalNAcT2的表达差异NIH3T3成纤维细胞、胃癌细胞株SGC-7109、白血病细胞株K562和NB4购自上海生化细胞所；RNA抽提试剂TRIZOL、PCR试剂盒、pUCMixDNAmarker和ladder购自Invitro

7、gen公司，六随机引物购自Takara公司。实验所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白（内对照）引物采用Geyx软件设计，并经GenBankBlast同源检索后由上海生工生物技术公司合成。β-MG引物序列为：F：5′-CTCGTGCTACTCTCTCTTTC-3′R：5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′预期扩增产物长度330bp。ppGalNAc-T2引物为：F：5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC-3′R：5′-CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC-3′

8、预期扩增产物长度为668bp。采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株RNA，测A260/A280比值和电泳图谱鉴定抽提完整性，测A260定量，六随机引物逆转录制作cDNA。倍比稀释点膜，用pp-GalNAcT2特异的寡核苷酸探针与膜杂交；同时以上述获得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株cDNA加pp-GalNAcT2和β-MG正反向引物行RT－PCR来验证斑点杂交结果。2结果(1)尼龙膜上不点任何样