klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用论文

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1、Klotho蛋白对帕金森病模型小鼠的神经保护作用论文【摘要】目的观察Klotho蛋白对1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)诱导所致C57BL/6小鼠黑质神经元损伤的保护作用，并探讨其可能的保护机制。方法C57BL/6小鼠分4组：野生型(PTP(PTP)组，Klotho蛋白高表达型(KO)生理盐水对照组(KO+NS)，Klotho蛋白高表达型MPTP组(KO+MPTP)。PTP组和KO+MPTP组小鼠皮下注射MPTP(20mg/kg).freela公司;TH免疫组化试剂盒、DAB试剂购自美国VectorLaboratories公司;

2、高效液相色谱仪为美国PTP的急性毒性反应，观察6d内小鼠的行为学改变，包括反应、自发活动、肌肉运动、运动障碍、异常行为等。1.3TH免疫组织化学染色1.3.1取材及冰冻切片于末次注射7d后将小鼠安乐死，然后断头取脑组织，置于含50mg/ml多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲固定液(PBS)中4℃固定6h，再置入含250g/L蔗糖的PBS溶液内4℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。将脑组织块于冠状黑质平面连续冰冻切片，片厚30μm。所切连贯切片按序号保存于PBS液内，每只鼠所得切片中隔5取1共取5张连贯切片进行TH免疫组织化学染色。各组切片选取部位尽量一致。1

3、.3.2TH染色切片置入0.1mol/LPBS(pH7.4)冲洗3次每次10min;PBS+H2O2(2∶1)冲洗30min;0.1mol/LPBS冲洗3次每次10min;切片入滴加血清3滴的10mlPBS溶液中孵育30min;加一抗(1∶4000，用抗体稀释液稀释)，于湿盒内4℃过夜;第2天PBS冲洗3次，每次10min;滴加生物素标记的二抗工作液，孵育30min;PBS冲洗3次，每次10min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育1h;PBS冲洗3次，每次10min;Acetate缓冲液冲洗10min;DAB显色4～5min;Aceta

4、te缓冲液冲洗10min，PBS冲洗3次，每次10min;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并照相。因DAB显色液中加入Nickel，阳性细胞为细胞质和突起着蓝色。1.3.3阳性细胞计数在每只鼠SNc连贯切片中隔5取1，共得5张切片，各组切片选取部位尽量一致。对照图谱，应用StereoInvestigator软件在低倍视野下勾出SNc边界〔4〕，设定计数范围，高倍视野下计数选取框内阳性细胞数,顺序为由左至右,自上而下,不完全位于视野内的细胞不计数。用StereoInvestigator软件分析TH阳性细胞计数结果，每只鼠每张切片的细胞总

5、数和SNc的细胞总数由软件统计。系统误差由软件统计，要求小于等于0.06。1.4纹状体(Str)内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)含量的测定1.4.1组织样品的制备及预处理各组小鼠断头取脑组织,于冰盒上分离并保留纹状体组织,保存于-80℃冰箱备用。将组织样品称重，加入冰冷的样品预处理A液100μl,冰浴中超声匀浆10s,冰浴静置1h，注意避光保存。4℃条件下，17000r/min离心7min〔5〕，取80μl上清液，加入40μl冰冷的预处理B液，涡旋混匀，冰浴静置1h，4℃条件下，17000r/min离心7min，-80

6、℃冷冻保存待测。1.4.2上样分析及绘制标准曲线设定样品流量1.0ml/min，ECD设定电压0.65V，每一样品检测35min。各标准品分别进样，检测其保留时间作为定性指标。DA、DOPAC、HVA的标准溶液最后用流动相倍比稀释得6个浓度梯度:每20μl含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5ng。分别进样,检测并绘制标准曲线。测定纹状体DA、DOPAC、HVA的含量变化。1.5统计学处理实验结果以表示,应用SPSS11.0统计软件进行数据处理。组间均数比较采用单因素方差分析。为了比较Klotho蛋白对MPTP诱致PD模型小鼠的神经保护作

7、用，计算MPTP组和Ns对照组之间的损伤百分率。公式如下：损伤百分率=NS对照组MPTP组NS对照组×100%。2结果2.1各组小鼠行为学的变化PTP组小鼠在MPTP注射后数分钟可出现阵发性躯干震颤、竖毛、竖尾、频繁的窜蹦及爬杆不能等短暂的行为反应,随后出现活动减少,但次日略见恢复;KO+MPTP组上述表现不明显。PTP组与KO+MPTP组均出现反应迟钝、步态不稳、自发活动减少等行为学改变。2.2各组小鼠SNc内TH免疫组化染色结果PTP组黑质致密部TH阳性神经元减少，TH阳性纤维和胞体稀疏，TH阳性神经元数量减少，阳性染色较弱。镜下可见残留神经元

8、皱缩，突起减少或消失(图1)。KO+NS组小鼠黑质致密部可见TH阳性神经元和纤维，细胞较大，多为椭圆形，胞浆