马棘70%醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

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1、马棘70%醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响作者：胡泽华，郜邦鹏，黄德斌【摘要】　　目的探讨马棘70％醇提取物（IPM）的抗动脉粥样硬化作用及机制。方法用不同浓度的马棘、肝素孵育体外培养的小鼠单核巨噬细胞RA对低密度脂蛋白受体（LDL-R）蛋白和mRNA表达的影响。结果马棘能明显降低小鼠单核巨噬细胞RAatsum(IPM).MethodsThecellousemacmphageRAcanreversethiseffectofOX-LDL.Thismaybeoneofantiatherogenicmechanism.　　Key(IP

2、M)；Macrophage；Lo，IPM）为豆科木篮属植物，以根或全株入药。又名一味药、野绿豆、马料梢、山皂角、野篮枝子。性味苦、涩，平，具有清热解毒、消肿散结之功效。用于感冒咳嗽，扁桃体炎，颈淋巴结结核，小儿疳积，痔疮；外用治疔疮。该植物广泛分布于全国各省市，资源丰富［1～3］。我们曾研究发现马棘醇提取部位具有显著镇痛作用［4］。本研究探讨70%马棘醇提物（IPM）对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响。　　1材料与方法　　1.1试剂与仪器　　Gibco公司DMEN培养基和小牛血清；抗LDL-R多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；LD

3、L（中国协和医科大学基础生化所）；大连宝生物工程有限公司逆转录系统和PCRcoresystem；引物（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠单核巨噬细胞RAatsum，IPM），经10倍量70%乙醇回流提取两次，过滤，浓缩蒸干，研末，收率为14.3%。　　1.3小鼠单核巨噬细胞RAEN培养液，通以5%CO2恒温37℃培养48～72h，细胞融合后，用0.1％胰蛋白酶和EDTA0.08%的混合消化液消化传代。实验前将细胞接种于细胞培养板，在无血清、无酚红的培养液中通以5%CO2，37℃，培养12h备用。　　1.4氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的制备［

4、6,7］　　将LDL置于恒温37℃、pH7.2的PBS溶液（CuSO4，10μmol·L-1）透析24h，在含0.1%EDTA的PBS中透析24h终止反应，0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反应物质值来表示。结果OX-LDL为21.4μmol·L-1，LDL为2.2μmol·L-1，说明LDL被氧化。　　1.5动物分组共分6组，即：对照组（controlgroup,CG）；OX-LDL组（OX-LDLgroup,OLG）；肝素组（100mg·L-1,heparingroup,HPG）；IPM100，200，400

5、mg·L-1保护组（IPM-100,200,400）。取细胞计数为1×108个细胞·L-1的备用传代培养细胞，按每孔500μl接种于6孔板，每组5孔，12h细胞融合后，更换无血清无酚红DMEN培养液，后4组（HPG和IPM-100,200,400）分别加入相应浓度的肝素和IPM预处理，培养12h后，除CG外，其余各组分别加入50mg·L-1OX-LDL培养24h获细胞。　　1.6LDL-R表达的检测（免疫酶标记法，SABC）［6］　　取细胞爬片，内源性过氧化酶以3%H2O2灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠LDL-R一抗，4℃，次日加山羊抗兔lgG二

6、抗；加SABC复合物，DAB-H2O2显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同VIDAs图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞RA对RA-100,200,400mg·L-1均能提高LDL-RmRNA的表达，且呈现浓度依赖趋势，以IPM-400mg·L-1作用最强，与IPM-100和200mg·L-1对比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）.结果见图1及表1。表1IPM对RARNA表达的影响（略）　　2.2IPM对RA对OX-LDL引起的LDL-R表达下调均有保护作用，以400mg·L-1组作用最强，与

7、IPM-100和200mg·L-1对比有显著性差异（P<0.01）；肝素（100mg·L-1）对OX-LDL引起的LDL-R表达下调无明显作用，与CG相比无显著差异（P>0.05）。结果见表2。表2IPM对RAEK/ERK信号转导进行，并与LDL-R基因启动子中的重复序列3有关［9］。　　本研究发现OX-LDL可降低LDL-R表达，与有关报道一致［8］。其机制可能为细胞摄取OX-LDL后，使胞内胆固醇浓度升高，通过由胆固醇介导的负反馈抑制性机制，抑制了SREBP与SREi结合，进一步抑制LDL-R转录与翻译［10］。IPM可逆转OX

8、-LDL对LDL-R的下调，而且呈现浓度依赖趋势。其作用机制可能是：抑制泡沫细胞的形成，降低胞内胆固醇含量有关［9］，即通过降低胞内胆固醇含量，减少胆