survivin反义寡核苷酸激活caspase

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1、survivin反义寡核苷酸激活caspase【摘要】目的研究转染生存素(survivin)反义寡核苷酸诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及其可能的作用机制。方法实验分为空白对照组(Control组)、脂质体组（Lip组）、正义寡核苷酸组（Sodn组）及反义寡核苷酸组(Asodn组)。人工合成正、反义寡核苷酸，经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入胃癌细胞48h后，MTT检测细胞增殖抑制率，ethodsTheexperimentincludedfourgroups:control,liposome(Lip),s

2、enseoligonucleotide(Sodn)andantisenseoligonucleotide(Asodn).Artificiallysynthesizedsurvivinantisenseoligonucleotidee.Aftercultivation,thecellproliferationinhibitionrateinedorphologicalchangesofapoptosisetricanalysis.ResultsFluorescencemicroscopicobservationsrev

3、ealedthatHoechststaininginthecontrol,LipandSodngroupshadnucleuspresentedasnormalblue,concentration,karyorrhexisandapoptoticmodifications.Asodngrouphadasignificantincreaseinthecellproliferationinhibitionrate,cellapoptosisrateandexpressionofcaspase-3protein,pared

4、echanismmightbethattheapoptosissignaltransductionisinitiatedbytheactivationofcaspase-3expression.Keyine2000及无血清、无抗生素培养液Optimem购自Invitrogen公司产品，兔抗人caspase-3抗体及碱磷酶标记的羊抗兔IgG购自SantaCruz公司，兔抗羊β-actin购自美国Chemicon公司，MTT购自Sigma公司，Annexinv-FITC及Hoechst33258染色试剂盒购自碧云天生物技

5、术研究所。反义寡核苷酸(Asodn)序列为：5′-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3′，正义寡核苷酸(Sodn)序列为：5′-CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG-3′，均全程硫代修饰，5′端以绿色荧光蛋白标记。Asodn、Sodn均由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2.1实验分组及细胞转染实验分组：空白对照组(Control组)、脂质体组（Lip组）、正义寡核苷酸组（Sodn组）及反义寡核苷酸组(Asodn组)。SGC7901胃癌细胞常规培养至细胞融合约90％时进行转染。用Optimem分

6、别稀释Lip、Sodn及Asodn至实验所需浓度并轻轻混匀，5min内将Sodn和Asodn稀释液与Lip稀释液混匀，并在室温中保温20min使之充分结合，加样前将板孔中的培养基换成无血清、无抗生素的Optimem培养液,加样，轻轻混匀，37℃CO2温箱中培养，5～6h时先吸掉培养基混合物，再加入有血清全培养液，继续培养进行以下实验。1.2.2MTT检测细胞增殖抑制率实验分组同前，Sodn、Asodn终溶度均取300nmol/L(根据预实验选择数据)，各组设3个复孔，均按每孔5×103个细胞数接种于96孔板，培养至9

7、0％细胞融合时转染，于转染24、48、72h后570nm波长处测定光密度值（D570），细胞抑制率(%)=(1-D570处理组/D570对照组)×100%。1.2.3in，4℃下12000r/min离心5min，Forlin酚法测蛋白浓度，以100μg/孔上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜封闭后分别加入一抗兔抗人caspase-3及兔抗羊β-actin多克隆抗体,4℃下孵育过夜，碱磷酶标记羊抗兔IgG,孵育2h，NBT/BCIP显色。一抗兔抗人caspase-3及兔抗羊β-actin多克隆抗体工作浓度分别为1∶

8、1000和1∶500，二抗工作浓度均为1∶1000。用图像分析系统测定各条带灰度值,并用图像分析软件进行分析（ImageJ）。caspase-3蛋白表达水平以相对表达量即caspase-3/β-actin吸光度的比值计算。1.2.4Hoechst染色检测细胞凋亡形态改变及流式细胞仪检测细胞凋亡率各组取对数生长期细胞，以每孔3×105个细胞数接种