pcr产物胶回收实验

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1、实验六PCR产物胶回收实验一、实验目的1.掌握胶回收的常规操作2.了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，

2、限制性酶切等各类下游分子生物学实验。三、试剂及配套设备和材料3.1试剂ExtractionbufferWashbufferElutionbuffer3.2配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3MKAc(pH5.0)离心机四、基本技术参数提取方法操作时间离心柱溶剂提取DNA片段范围洗脱液回收率样本用量离心柱16分钟内完成2个样本750ul60bp~23kb≥99%最大400mg凝胶条适用琼脂糖种类适用电泳缓冲液温育温度高/低熔点琼脂糖TAE/TBE

3、缓冲液50℃（低熔点琼脂糖）55℃（普通琼脂糖）五、操作步骤1.用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0ml离心管中。请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的DNA上样量≥50ul（50ul为最终洗脱体积）。2.按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extractionbuffer。例如：100mg凝胶应加入300ulExtractionBuffer。对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。3.于恒温水浴或金属浴中50℃

4、温育，直到凝胶融化。一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10ul3MKAc（pH5.0），使混合液颜色变回黄色。4.可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。5.将混合液全部转移到Spincolumn内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。6.向Spincol

5、umn内加500ulExtractionBuffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。7.向Spincolumn内加750ulWashBuffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Washbuffer后静置2~5分钟，再离心。8.再次于12,000rpm离心1分钟，然后将spincolumn转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。9.向Spincolumn内

6、加50ulElutionBuffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定ElutionBuffer用量。但不要低于20ul。10.于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。六、注意事项1.为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。2.为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引

7、起的一些后续麻烦。2.在洗脱前，将洗脱液于30~60℃温浴，可提高提取效率。七、思考题1.简述影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。2.简述PCR上样缓冲液（loadingbuffer）的成分及其作用。