cox2和vegf与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系论文

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1、COX2和VEGF与肝癌多细胞球体群集耐药性的关系论文姚煜，田涛，崔洁，赵娜，郭亚焕，南克俊【摘要】目的：探讨COX2和VEGF在肝癌多细胞球体（MCS）中的表达与肝癌群集耐药的关系.方法：以liquidoverlay技术获得肝癌HepG2多细胞球体为模型，采用透射电镜和扫描电镜比较单层细胞与MCS的形态学差异；采用MTT法和流式细胞技术比较ADM和5FU对单层细胞和MCS的生长抑制率和细胞凋亡率；采用免疫组化和图像分析技术比较COX2和VEGF在单层细胞和多细胞球体表达的差异.结果：与单层细胞相比，多细胞球体

2、细胞间黏附广泛而紧密.freelulticellularspheroids，MCS）对阿霉素（adriamycin，ADM）和5氟脲嘧啶（5fluorouracil，5FU）的耐药性以及环氧化酶2（cyclooxygenase2，COX2）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgroulticellularresistance，MCR）中的表达的关系，探讨肝癌MCS的耐药机制.1材料和方法1.1材料人肝癌HepG2细胞购自美国ATCC，由本室保存；RPMI1640培养液购自Gibco公司

3、；噻唑兰（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；AnnexinVFITC试剂盒购自晶美生物公司；COX2鼠抗人mAb和VEGF鼠抗人mAb购自SantaCruz公司.透射电镜（Hitachi，H600）；扫描电镜（JEOL，JSM840）；高通量多功能微板测试系统（BMG，PolarStarOPTIMA）；流式细胞仪（BD，FALSCalibar）；图像信号采集与分析系统（Leica，Q550CCS.1.2方法1.2.1细胞超微结构观察取平面细胞和MCS，置于25g/L戊二醛固定液中4℃固定2h，

4、10g/L四氧化锇固定液4℃后固定2h，乙醇梯度脱水，置换，切片，喷金后用透射电镜和扫描电镜观察.1.2.2细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中，在不同浓度ADM和5FU作用48h后，每孔加入5g/LMTT20μL，继续孵育4h后弃上清，每孔加入150μLDMSO振荡5min，于492nm波长处检测每孔A值，以不加药物组为空白对照，计算细胞抑制率.细胞抑制率（%）=［(1-实验组A值)/对照组A值］×100%.1.2.3细胞凋亡的检测单层细胞和MCS分别经不同浓度ADM和5FU作用48h后收集，按照试剂盒说明书加

5、入AnnexinVFITC和PI，避光染色15min后，上机检测细胞凋亡率.1.2.4检测COX2和VEGF的表达单层细胞制作细胞爬片，40g/L多聚甲醛固定20min后备用.MCS40g/L多聚甲醛固定1h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片后备用.根据试剂盒说明进行免疫组化染色，阴性对照用PBS代替一抗.用LeicaQ550c左右(图1C)，细胞间黏附广泛而紧密，可见桥粒连接和中间连接（图1D）.2.2单层细胞和MCS细胞抑制率的比较MTT实验结果表明，除0.15625mg/L组以外，经0.3125，0

6、.625，1.25和2.5mg/L的ADM作用48h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞（P0.05，图2A）；经6.25，12.5，25，50和100mg/L的5FU作用48h后，MCS的细胞抑制率低于单层细胞（P0.05，图2B）.2.3单层细胞和MCS细胞凋亡的比较经0.5，1.0，2.0mg/LADM作用48h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞（P0.05，图3A）；经40和80mg/L5FU作用48h后，MCS的细胞凋亡率低于单层细胞（P0.05，图3B）.在20mg/L5FU组两者的细胞凋亡未见明显差异

7、.A:扫描电镜下单层细胞形态（×1000）;B:透射电镜下单层细胞形态（×3000）;C:扫描电镜下MCS形态（×370）;D:透射电镜下MCS形态（×60000）2.4COX2和VEGF的表达差异COX2和VEGF主要在胞质表达，呈棕黄色颗粒，对表达阳性的样本进行图像分析，测平均灰度值作为表达强度的量化指标.将单层细胞培养成MCS时，COX2和VEGF的表达均增高（P0.05）：单层细胞COX2的灰度值为190.8±9.4，MCS的平均灰度值为153.9±10.2；单层细胞VEGF的灰度值为207.4±8.8

8、，MCS的灰度值为186.8±13.9.光镜下观察，单层细胞COX2和VEGF仅个别细胞有弱的染色，而MCS大部分细胞有较强的染色（图4）.A:COX在单层细胞中的表达;B:COX在MCS中的表达;C:VEGF在单层细胞中的表达;D:VEGF在MCS中的表达.图4COX2和VEGF在单层细胞和MCS中的表达×2003讨论肝癌耐