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1、人肺上皮细胞表达蛋白酶激活受体作者：王海燕,何韶衡,付意玲,方泽曼【关键词】蛋白酶激活受体Expressionofproteaseactivatedreceptorsonhumanlungepithelialcells 【Abstract】AIM:Toexploretheexpressionofproteaseactivatedreceptors(PARs)onlungepithelialcells.METHODS:EM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，TRIZOLReagent购自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRki
2、t,购自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝胶染料购自BMA公司,PCRMarkers购自Biolabs公司.PE标记的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗体及相应的同型对照均购自SantaCruz公司.FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自BDPharmingen公司.PCR仪PTC200购自MJResearch公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本Nikon公司，FACSCalibur流式细胞仪购自BectonDickinson公司. 1.2方法 1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞接种于50m
3、L培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃,50mL/LCO2培养箱中培养. 1.2.2RTPCR收集培养的A549细胞，用TRIZOLReagent提取细胞总RNA，具体操作步骤按试剂说明进行.RNA经10g/L琼脂糖电泳后，按TAKARARTPCRkit说明进行cDNA合成.逆转录的条件为：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成.βactin（F）5′A
4、GGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGT
5、G3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR扩增条件为：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR扩增条件为：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4扩增的目的片段分别为500,461,403和401bp；βactin的扩增片段为202bp.PCR扩增片段经测序验证. 1.2.3流式细胞术分析待培养细胞生长至70%~80%时，用非酶性
6、细胞分离液悬浮细胞，10g/LBSA/PBS洗2次，调整细胞密度为5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室温固定10min,按说明书分别加入1∶20PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS悬浮细胞，使用流式细胞仪CELLQUEST软件检测和分析上皮细胞PAR的表达情况.
7、 1.2.4免疫荧光细胞染色将A549细胞接种于8孔显微镜玻片培养过夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦显微镜下观察. 2结果 2.1肺上皮细胞PARsmRNA的表达肺上皮细胞表达PAR1，
8、PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，扩增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的长
