hv单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白1a8 scfv-cκ-p的构建和表达论文

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1、HV单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8ScFv/Cκ/P的构建和表达论文陈锐，杨洁，张芳琳，秦炜炜，王涛，张瑞，孟艳玲，胡刚.freeline，P）是一种碱性蛋白，截短至22个(8～29)富含碱性氨基酸片段仍然保留着核酸结合功能.单链抗体（singlechain，scFv），分子小，穿透力强，免疫原性低，有导向载体功能.我们构建和表达一种由汉坦病毒（Hantavirus，HV）核蛋白的单链抗体（1A8scFv）和鱼精蛋白片段组成的融合蛋白1A8ScFv/Cκ/P，以期获得具有抗原结合活性和核酸结合活性的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白.1材料和方法1.1材料1A

2、8VHLGL/EM培养液，37℃，50mL/LCO2培养箱中培养7d.待细胞长满孔板，去培养液，用2.5mL/L戊二醛固定10min.在孔中分别加入100μL不同稀释梯度的蛋白样品，37℃孵育1h.加入鼠抗6HismAb(1∶10000稀释)，37℃孵育1h.加入底物液100μL/孔，37℃，10min显色，终止反应后测定各孔A492nm值.1.2.6融合蛋白的核酸结合活性检测采用凝胶迁移阻滞实验.将1μg线性化质粒DNA分别与不同量的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白于0.2mol/LNaCl溶液中室温孵育30min，10g/L琼脂糖凝胶电泳分离，观察结果.2结

3、果2.1重组表达载体的构建及鉴定PCR分别扩增出长度为750bp的HV1A8ScFv基因片段、1068bp的1A8ScFvCκ片段和1134bp的1A8ScFv/Cκ/P片段，片段的大小均与预期长度一致（图1A）.1A8ScFv/Cκ/P基因克隆入PET32a载体，克隆的酶切鉴定正确(图1B).核苷酸序列测定结果正确.A1：DL2000marker；2：1A8ScFv基因的PCR产物；3：1A8ScFv/Cκ基因的PCR产物；4：1A8ScFv/Cκ/P基因的PCR产物.B1：DL2000marker；2：pET32a1A8ScFv；3：pET32a1A8S

4、cFv/Cκ；4：pET32a1A8ScFv/Cκ/P（EcoRI,SalI）.图11A8ScFv/Cκ/P基因的PCR扩增产物和其重组质粒的酶切鉴定2.21A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的诱导表达及鉴定与空载体相比，经0.2mmol/LIPTG诱导后细菌裂解上清及沉淀中均出现Mr约为60000的新生蛋白带，与预期的1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的大小相符.光度扫描显示，1A8ScFv/Cκ/P融合蛋白的可溶性表达量占上清蛋白的30.9%（图2A）.经ed,2003,9(3)：347-351.［2］SuzukiM,TakayanagiA,ShimizuN.Ta

5、rgetedgenedeliveryusinghumanizedsinglechainantibodyediatedsmallinterferingRNAdelivery［J］.Hepatology，2007,46(1)：84-94.［4］,KreuterJ,ZimmerA.Antisensedeliveryusingprotamineoligonucleotideparticles［J］.NucleicAcidRes,2000,28(10):e45.［6］LiX,StuckertP,BoschI,etal.Singlechainantibodymedia

6、tedgenedeliveryintoErbB2positivehumanbreastcancercells［J］.CancerGeneTherapy,2001,8(8)：555-565.