氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究

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1、氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究作者：林玉双洪文荣林烨梁枝定【摘要】目的筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价。方法以黑暗链霉菌Ts228为出发菌株，经自然分离，UV诱变结合耐自身代谢产物处理，采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了Tt49新菌株。以摇瓶发酵考察生长特性，罐上发酵绘制代谢曲线。结果效价提高了1.8倍，妥布霉素含量高达68.5%。该菌株生长周期仅4d，传代稳定。种龄18h左右，接种量10%。按照代谢曲线图进行调控，发酵罐的产抗水平达5865u/ml。结论自然分离与诱变相结合，是

2、黑暗链霉菌选育的有效途径。出发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显著提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。【关键词】黑暗链霉菌；氨甲酰妥布霉素；深层发酵；抗生素ABSTRACTObjectiveScreeningahighandstablemutantstrainfromS.tenebrariusTs228forCTB(carbamoyltobramycin)production.MethodsAparentstrain(Ts228)ycin.Finally,ahighyieldmutantTt49en

3、tationenter.ResultsAmutantstrainTt49entationtitreincreasedto5869u/mleshigherthantheparentstrainTs228,andtheponentratiooftobramycinesupto68.5%.ThefermentationcourseofTt49onlyneed4days.The18hseedmyceliumand10%CC(B)63501］，本实验室保藏菌。培养基(%)①斜面：葡萄糖3.0，蛋白胨0.5，氯化钾0.0

4、5，FeSO4·7H2O0.001，磷酸氢二钾0.10，硫酸镁0.05，琼脂2.0，pH自然；②种子：葡萄糖0.5，玉米淀粉1.0，黄豆饼粉1.5，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.05，氯化钾0.1，CaCl20.025，pH自然；③发酵：葡萄糖1.5，玉米粉2.0，黄豆饼粉3.5，硫酸铵0.7，硫酸镁1.1，碳酸钙0.7，硫酸锌0.01，玉米淀粉2.0，豆油1.0，pH7.0～7.2。仪器生化培养箱(LRH250A)；220r/min摇瓶机(自制)；15L种子罐和50L发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)；台式离心

5、机(TGL16G)。妥布霉素标准品和生测培养基：中国生物制品检定所。1.2分析方法发酵效价采用生物检定法［6］；组分检测用薄板层析［6］和HPLC法［7］。菌丝浓度测定，取发酵液10ml，3000r/min离心10min，去上清液后的固体物作为相对菌丝浓度。其它项目(总糖、还原糖、氨基氮等)均采用工业化常规分析法［8］。2结果与讨论2.1自然分离出发菌株黑暗链霉菌Ts228主产尼拉霉素2，4和5′三个组分，菌落较大，孢子乳白，生测效价为3260u/ml。该菌株的单孢子悬液经自然分离获得白色和淡黄色两类菌落，琼脂块法

6、检测菌落的抑菌效果。结果显示白色菌落抑菌活性高于淡黄色菌落，具备较好的生产潜力；淡黄色菌落在多次测定中抑菌活性均较低，参照(3)冷藏对稳定性的影响为了考察冷藏对斜面孢子稳定性的影响，将置于4℃冰箱保存不同时间的表2斜面孢子培养时间对效价的影响由表3可见，斜面在冰箱保存7d内，对发酵效价影响不大；保存时间12d以上，不仅对种子的菌丝形态(镜检)，而且对发酵效价均有明显的影响。因此建议采取低温干燥予以保存，生产斜面以新鲜为宜。2.5种子特性考察(1)种龄的确定种龄控制不当，影响菌种生产能力的发挥。移种过早，潜伏期较长，甚

7、至长不起来，即使生长了也容易衰老；移种太晚，种子走向衰老，不利于发酵和合成抗生素。为此，考察了种子培养时间对发酵效价的影响，借此来确定合理的菌龄，结果见表4。由表4可以看出，移种时间控制在16～20h，对效价无太大影响，总效价均在4800u/ml以上。18h(pH6.74，菌浓10%)移种，发酵效价最高，此时种子液颜色转黄，出现挂壁现象，镜检菌丝粗壮，分支多，染色深。当接种时间延长到24h时，种子菌丝开始变细、变长，空胞逐渐增多，发酵效价反而有所降低。由表4数据还可以看出，种子的菌丝浓度高不等于种子质量好，22h的种

8、子浓度达12%，但最终发酵效价不高，因此，表3冷藏时间对生产力的影响把握好合适的菌龄是把握好发酵的关键之一。(2)接种量的确定接种量的多少，决定了产生菌在发酵开始的生长繁殖速度和潜伏期的长短，同时也影响其最终产抗生素的水平，因此，确定菌龄之后，对接种量进行考察。将培养18h的种子按不同接种量(1%，3%，5%，8%，10%，15%)接入发酵瓶(