ag490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制

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1、AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制作者：姚林方，叶章群，陈志强，刘冠琳，孔德波，杨为民【摘要】目的观察JAK2激酶抑制剂AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其抗癌机制。方法应用不同剂量AG490处理膀胱癌细胞系BIU87，台盼蓝排斥试验检测细胞活力，噻唑蓝比色试验检测细胞增殖，克隆形成试验进一步检测膀胱癌细胞系干细胞对药物的敏感性，Hoechst33258/PI荧光双染检测细胞凋亡特征，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，echanismofAnticancerEffectsofJanusKinaseInhib

2、itorAG490inHumanBladderCancer　　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheanticancereffectsofJanusKinaseselectiveinhibitorAG490inhumanbladdercancer.MethodsThebladdercancercelllineBIU87cellstoAG490ationcountingassay.FluorescencedyestuffHoechst33258andPIdoublestainingas

3、sayetryeasuredbyarkablyinhibittheproliferationofbladdercancercellsandtheformationofthetumorstemcellclones,blockthecellcycle,facilitatetheapoptosisofbladdercancercells,andresultinlessexpressionofpJAK2,STAT3,pSTAT3,CyclinD1andbclxL.ConclusionAG490sho公司。胰蛋白酶、噻唑蓝(

4、MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、双苯并咪唑染料(Hoechst33258)和碘化丙啶(PI)均购自美国SIGMA公司。AnnexinⅤFITC凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司。TT法　　细胞接种于96孔板中，贴壁后无血清培养24h，使细胞同步化。按上述方法处理细胞，分别培养24、48和72h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，继续孵育4h，终止培养，吸尽孔内上清。每孔加入150μlDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定570nm波长处光吸收值（A值）。细胞抑制率（%）=（1实验组A值/对

5、照组A值）×100%。　　1.2.3克隆形成试验　　制备单个细胞悬液，作梯度倍数稀释，按每皿300个细胞接种于培养皿中，细胞同步化和AG490处理同前，更换完全培养液继续培养2周后，用PBS（0.01mol/L，pH7.4）浸洗2次，甲醇固定后，加适量姬姆萨染色，浸洗干燥，计数克隆数。50个细胞以上的集落算一个克隆，克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%　　1.2.4Hoechst33258/PI荧光双染　　在6孔板中铺板爬片，细胞同步化和AG490处理同前，加入Hoechst33258（5μg/ml）100μl

6、，37℃避光反应10min。继续加入PI（50μg/ml）100μl，4℃避光反应20min。4%多聚甲醛固定细胞10min后，置于荧光显微镜下观察细胞形态结构及胞核的变化，每张玻片随机选择10个视野并计数，区分出坏死、凋亡和活细胞（细胞核或细胞质内见浓染致密的颗粒状亮蓝色荧光者为凋亡细胞，细胞核着均匀的淡蓝色荧光者为活细胞，呈弥散均匀的红色荧光者为坏死细胞），并计算出凋亡率、坏死率及存活率。　　1.2.5细胞周期检测　　细胞接种于6孔板，细胞处理同上，收集细胞，PBS洗涤，70%冰乙醇固定，PI染色，应用FACSort

7、流式细胞仪（美国BectonDickson公司）进行检测，数据用美国BD公司CellQuest细胞周期分析软件进行储存及分析。　　1.2.6细胞凋亡检测　　用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250μl结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μlAnnexinⅤFITC（终浓度1mg/L）和10μlPI溶液（终浓度2mg/L），混匀后于室温避光孵育15min，再加入400μlPBS，上流式细胞仪检测（美国BectonDickson公司）。　　1.2.7SO+19ml

8、ddH2O充分溶解，每次腹腔注射10mg/kg体重。以上两组均隔日注射1次，4天测肿瘤体积1次，用药21天颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量瘤重。计算瘤体积=长×宽2×0.5，单位cm3，抑瘤率(%)=(1用药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%　　1.3统计学处理　　数据以±s表示，组间比较采用两样本