草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究

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1、草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究作者：随志刚陈明玉刘志强皮子凤刘忠英【摘要】目的优化草乌中乌头类生物碱提取方法，比较草乌、附子生品及市售炮制品中乌头类生物碱的含量，为相关中药中生物碱的测定和临床应用提供参考。方法分别用7种提取方法提取附子中乌头类生物碱，比较各方法对3种双酯型生物碱的提取效率，并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量。结果10%氨水乙醚冷浸法对3种双酯型生物碱的提取效率最高。炮制品中的乌头类生物碱含量明显低于生药，各种炮制品中乌头类生物碱的含量差别也比较大。结论采用10%氨水乙醚冷浸

2、法，高效液相色谱-紫外光谱（HPLC²UV）法对药材中乌头类生物碱进行提取和含量测定，能真实反映药材中药效和毒性成分。不同的炮制品中各生物碱含量差别较大，临床应用应有差别。【关键词】提取方法草乌附子乌头碱类生物碱在乌头类生药及炮制品中，生物碱成分既是药效成分同时也是毒性成分［1］，而且稳定性不好，很容易降解［2］，所以生物碱的提取方法在其成分分析中十分重要。目前有关生物碱的提取方法有很多［3～5］，但是，各种方法对双酯型生物碱的提取效率的比较研究尚无报道。中医临床常用的乌头类中药为附子的炮制品，

3、市售的附子炮制品饮片按不同的炮制方法分为盐附子、黑附片、白附片、淡附子、熟附片及炮附子等［6］，但是，不同的炮制方法，必然会造成生物碱含量的不同，在使用上应有所区别。本文比较了7种提取方法对乌头类中药中3种双酯型生物碱的提取效率，并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量，以期准确测定附子中生物碱,为保证此类中药的临床应用更为安全合理提供可靠的分析方法。　　1仪器与试剂　　1.1仪器LC-10A高效液相仪（Shimadzu，日本）；超声清洗器（Autoscience,天津）；高速离心机（Eppendor

4、f，德国）；电子天平（Sartorius，德国）。　　1.2试剂乌头碱，中乌头碱和次乌头碱对照品购自中国药品生物制品检定所。生附子、生草乌购自四川江油，制草乌、黑附片、白附片、盐附子、淡附子购自吉林省长春市吉深药店，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定均为正品。甲醇为色谱纯,水为去离子水，乙醚、二氯甲烷等其他试剂为分析纯。　　2方法与结果　　2.1方法学考查　　2.1.1色谱条件AgilentextendedC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇∶0.1%三乙胺（65∶35）；流速为0.6

5、ml·min-1；检测波长为230nm；柱温为30℃；样品经过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液进样10μl。　　2.1.2标准曲线精密称取中乌头碱、乌头碱和次乌头碱对照品适量置于容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并定容，得浓度为1.08mg·ml-1的中乌头碱、1.12mg·ml-1的乌头碱和1.22mg·ml-1的次乌头碱标准品储备液。每种对照品溶液分别进样2，4，6，8，10μl，高效液相色谱法测定。以浓度（μg·ml-1）对峰面积计算回归曲线。得到中乌头碱标准曲线方程为Y=20672.0X-58377.5，r

6、=0.9995；乌头碱标准曲线方程为Y=18114.2X-28544.2，r=0.9999；次乌头碱的标准曲线方程为Y=186632X-13386.7，r=0.9993。说明乌头碱在5.6～112μg·ml-1、中乌头碱在5.4～108μg·ml-1，次乌头碱在6.1～122μg·ml-1的浓度范围内均呈良好的线性。　　2.1.3重复性实验同一生草乌粉末按优选的提取方法操作，提取6份溶液，HPLC测定，记录乌头碱、中乌头碱、次乌头碱峰面积。乌头碱、中乌头碱和次乌头碱含量的RSD值分别为4.32%，3.57

7、%和4.84%。说明方法重复性较好。　　2.1.4回收率实验精密称取已知含量的生草乌粉末18份，每份0.2g。第1个6份分别加入0.05mg乌头碱，第2个6份分别加入0.4mg中乌头碱，第3个6份分别加入0.2mg次乌头碱，同法操作计算含量，乌头碱的平均回收率为91.2%，RSD值为2.84%；中乌头碱的平均回收率为90.4%，RSD值为3.12%；次乌头碱的平均回收率为92.8%，RSD值为3.10。表明方法回收率较好。　　2.1.5稳定性实验同一生草乌粉末样品溶液保存于-80℃冰箱中，于放入冰箱后第4

8、，8，12，18，24小时测定，计算含量。24h内乌头碱、中乌头碱和中乌头碱含量的RSD值分别为5.21%，4.35%和6.24%。表明提取液在-80℃冰箱中24h内较稳定。　　2.2提取方法的优选　　2.2.1水提氯仿萃取法称生草乌2.0g于带塞锥形瓶中，加30ml蒸馏水，振荡6h后，转移至50ml离心管中，3000r·min-1离心20min，取上清液，沉淀水洗2次，合并上清液，用10%氨水调pH值为10，分别加入15，5