肾透明细胞癌中vhl基因改变和趋化因子受体cxcr4的表达及相关性

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1、肾透明细胞癌中VHL基因改变和趋化因子受体CXCR4的表达及相关性作者：曹正国，孙友文，诸禹平，樊龙昌，苏红，舒启安【摘要】目的研究肾透明细胞癌(CCRCC)组织中VonHippel-Lindau(VHL)基因改变和趋化因子受体CXCR4的表达及其相关性，探讨VHL基因在CCRCC中的作用。方法分别采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析、微卫星法、DNA甲基化特异性PCR和半定量逆转录PCR检测35例CCRCC和20例正常肾组织中VHL基因突变、杂合性缺失(LOH)、异常甲基化及CXCR4mRNA的表达。结果VHL基因在CCRCC和正常肾组织中的改变率分别为74.29%、5

2、.0%，二者的差异有统计学意义(χ2=24.45，P<0.01)；VHL基因改变与CCRCC的临床分期、淋巴转移等密切相关(χ2=4.05、5.18，P均<0.05)，而与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤大小等均无相关性(P>0.05)。CXCR4mRNA在CCRCC中的表达率为77.14%，显著高于正常肾组织的5.0%；CXCR4的表达与CCRCC的病理分级、淋巴转移密切相关(χ2=7.35、4.24，P均<0.05)，而与其他临床病理特征等均无相关性。相关性检验表明CCRCC中VHL基因改变与CXCR4的表达密切相关(χ2=3.89，P<0

3、.05)。结论VHL基因突变和LOH导致其失活是CCRCC发生的重要分子机制，VHL基因和CXCR4可作为判断CCRCC预后的重要参考指标，并可负向调节CXCR4的表达。【关键词】肾透明细胞癌；VHL基因；趋化因子受体(CXCR4)；失活；甲基化；突变肾透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,CCRCC)是肾脏最常见的恶性肿瘤。虽然遗传学研究表明3号染色体短臂(3p)的缺失和易位与肾癌发生有关，但其分子机制尚不完全清楚。VonHippel-Lindau(VHL)基因是Latif等［1］在1993年从VHL家族中成功克隆出来的一种肿瘤抑制基因，定

4、位于3p25-26，全长约15kb，包含有3个外显子和2个内含子。大量研究证实VHL基因与肿瘤细胞生长、增殖及分化关系密切，在恶性肿瘤的诊断和治疗上具有重要的应用价值。趋化因子受体(chemokinereceptor,CXCR4)是一种广泛存在于不同类型细胞表面上的G蛋白偶联受体。近年来的研究发现CXCR4在多种肿瘤细胞中表达并可能在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。本文分别采用微卫星标志法、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerasechainreactionsingle-strandconformationalpolymorphism,PCR-SSCP)、DNA甲

5、基化特异性PCR(methylation-specific,MSP)和半定量逆转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)检测CCRCC和正常肾组织中VHL基因突变、3p的杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)、异常甲基化与CXCR4mRNA的表达及二者的相关性，探讨VHL基因改变在CCRCC中的作用及其机制。1资料与方法1.1一般资料收集我院和同济医院泌尿外科2004年1月-2006年12月手术切除并经病理证实的35例原发性非遗传性CCRCC患者的新鲜组织标本。所有患者术前均未行任何化疗、放疗，其中男性20例，女性

6、15例；年龄33-75岁，平均(55.6±8.1)岁；左肾22例，右肾13例。癌组织取肿块非坏死部分，参照Fuhrman病理分级：Ⅰ级14例、Ⅱ级11例、Ⅲ级10例；Robson临床分期：Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。20例正常肾组织取自肾结石行肾切除术后的标本。所有组织标本均为严格无菌采集后立即置-80℃冰箱保存备用。1.2主要试剂基因组DNA提取试剂盒，武汉博士德公司产品；Trizol试剂，Gibco公司产品；TaqDNA聚合酶、dNTPs、TaKaRaRNAPCR(AMV)Ver3.0试剂盒，大连宝生物工程有限公司产品；SP)分析基因异常甲基化采用MSP

7、法［4］。基因组DNA经亚硫酸氢钠修饰后，再经扩增产物说明该片段已发生了甲基化，出现VHLU扩增产物说明该片段未发生甲基化。1.3.6RT-PCR检测CXCR4mRNA表达根据Primer5.0软件设计VHL上游引物序列：5′-TCTCGGTCCACTCTTGTT-3′，下游引物序列：5′-GCCACTCAGGAGGATTAC-3′，预计扩增产物为362bp。RT反应条件：55℃30min，99℃5min，PCR反应条件：94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃1.5min，循环30次。PCR反应结束后，取5μL扩增