生防酵母诱导条件下lepr5基因表达、功能验证及管控方式的探索

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1、生防酵母诱导条件下LePR5基因表达、功能验证及管控方式的探索第一章文献综述1.前言果蔬采后病害造成严重的经济损失始终是国际关注的重点问题，在美国等发达国家至少有24%的采后果蔬因为病害腐烂而损失，如若将采收加工、储藏运输、货价销售等过程中的损失也计算在内，其损失更为巨大。在发展中国家，由于卫生和冷藏条件的缺乏，果蔬的采后损失甚至超过了50%(eyer,1981),并且有许多研究报道，化学杀菌刻具有一定的毒副作用(Romanazzi等，2012)。因此开发新型杀菌剂，特别是低毒、高效的新型杀菌刻是非常必要的，并且可

2、能仍然是今后控制釆后病害的一个重要研究方向(Russell,2006)。除化学杀菌剂之外，对果蔬釆后病害常用的防治方法还包括物理方法，如：（1)低温冷藏；（2)热处理；（3)气调储藏；（4)福射处理等。2.果蔬采后病害生物防治方法及机理目前用拮抗微生物控制果蔬采后病害的方法因其安全无毒、环境友好而成为当前的研究热点。近十年来，利用微生物进行生物防治取得了突破性的进展，被认为是最有希望的替代化学杀菌剂的方法之一。果蔬采后病害生物防治虽然只有20余年的历史，但是它所取得的进步是显著的。目前，在美国、南非等国已经出现了多

3、种注册生产的徵生物保鲜剂，如美国的Biosave、南非的YieldPlus等(R.R.Shanna,2009)为一些已报道的生物防治产品。在拮抗菌中，抬抗酵母由于具有遗传稳定、抑菌谱广、效价高、不产生抗生素、对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力等优点而成为研究的热点。根据已有的研究结果显示，撖生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，间接作用包括营养和空间的竞争，胞外活性物质的产生和诱导抗性等。生物防治通常是一个以上的机制共同作用的结果。第二章基因对罗伦隐球酵母诱导的响应表达及LePR

4、5蛋白序列的分析1.前言植物通过激活一系列抗性反应来抵制病原菌的侵染。Pathogen-related(PR)proteins作为抵抗病原真菌的重要基因，可由病原菌侵染及相关的环境因子诱导表达(VanLoon等1994;Ferreira等2007)。这些PR抗性蛋白根据序列信息、血清型关系及生物功能分为不同的家族(VanLoon等1994;VanLoon等2006)。植物PR5家族蛋白由于它的序列与奇异果甜蛋白(Co.3590),由梨表面分离得到并鉴定(Yu等，2007)。酵母在NYDA培养基（牛肉浸資8g，酵母粉

5、5g,葡萄糖l0g，琼脂20克，蒸馆水定容至lOOOml，高压灭菌）上28°C活化培养48h。活化好的酵母接到NYDB培养基(牛肉浸资8g,酵母粉5g,葡萄糖lOg，蒸饱水定容至1000ml,高压灭菌)中，在200rpm,28°C条件下培养24小时。培养后的酵母细胞在3000rpm条件下，离心10-15分钟，并用灭菌蒸饱水洗2次，以去除培养介质。用无菌蒸饱水重新悬浮酵母细胞后用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馆水调整到试验所需要的浓度。病原菌为链格拖alternata(CGMCCNo.3.

6、4578)，由IMCAS(InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,China)购得，实验室保存。左alternata在PDA培养基(200g去皮马钤薯加水煮20min后过滤，滤液中加入20g葡萄糖、20g琼脂，定容至1000ml，高压灭菌)25°C下培养7天后，将alternata抱子从PDA表面刮离将其悬浮在无菌蒸饱水中，用A球计数板的方法确定病原菌拖子的浓度，并用无菌蒸饱水调整到试验所需要的浓度(eJA结合处理对根橘PR5基因表达与相橘绿?病控制

7、效果的影响1.前言在过去的20年间，生防酵母作为一种有效的控制水果采后病害的方法由于其环境安全性而越加被公众接受（Janisiea等，2009;Droby等，2009)。巳有研究报道罗伦隐球酵母菌株(coccuslaurentii)作为一种采后生物防治酵母能够控制苹果的灰霉病(Roberts，1990)和桃果的青霉病(Zhang等，2007a)以及樹橘的绿霉病(Mekbib等，2011)。前期的研究报道表明枯红酵母(Rhodotorulaglutinis)和红冬拖酵母(Rhodosporidiumpaludigen

8、um)能够显著抑制采后草莓的腐烂(Zhang等，2007b)和櫻桃番箱果实的腐烂(ethyljasmonate(MeJA)作为一种挥发性物质广泛存在于各种植物中。MeJA在植物中作为一种信号分子，调控植物的各种发育过程以及植物对外界生物和非生物性胁迫的响应（Creelman和Mullet,1997;Cheong和Choi,2003)。已有研究报道MeJA能够