端粒酶rna特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性论文

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1、端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性论文.freels;telomere，terminaltrans-ferase;ribonucleases;transfectionAbstract:AIMToexploretheeffectsofhammerheadri-bozymeagainsthumantelomeraseRNAinovariancarcinomacells.METHODS期DNA含量明显升高.研究表明，针对端粒酶的肿瘤基因治疗可能是一条有效的治疗肿瘤的新途径.我们研究核酶对卵巢癌细胞端粒酶活性的作用.1材料和方法1.1材料卵巢癌细胞系HO-8910由本室保存;

2、脂质体购于LifeTechnologies公司;生物素标记试剂盒购于NEB公司;胎牛血清、G418、四唑盐（MTT）、亲和素、生物素标记辣根过氧化物酶、端粒酶活性检测试剂盒（TRAP-HybKit）均购于华美生物工程公司;真核表达载体pcDNA3由西京医院临床分子实验室提供.端粒酶特异性核酶由西京医院临床分子实验室构建，经全自动序列分析仪检测序列正确.针对hTR模板区设计一锤头状核酶，人工合成后，重组至克隆载体，酶切鉴定及序列分析检测正确，酶切回收后，定向克隆入真核表达载体pcDNA3，酶切鉴定序列正确.1.2方法用含100mLL-1胎牛血清，1×105UL-1青霉素和1×105U

3、L-1链霉素的1640培养基，37℃，50mLL-1CO2孵箱培养卵巢癌HO-8910细胞.脂质体介导的基因转染参照试剂说明书进行:细胞分成3组:①试验组:HO-8910细胞转染核酶载体-HO-8910/pRZ;②阴性对照:HO-8910细胞转染空的pcDNA3-HO-8910/pcDNA3;③空白对照:HO-8910细胞.将处于良好生长状态的HO-8910细胞接种在6孔板中，加入100mLL-11640培养基2mL，37℃，50mLL-1CO2培养至细胞50%汇合时供转染使用.转染前先吸弃培养液，用不含血清及抗生素的培养液洗细胞1次，加入脂质体-DNA复合物（每孔含培养液1mL，

4、脂质体10μg，质粒DNA2μg），于37℃，50mLL-1CO2孵箱中培养5h，加含200mLL-1胎牛血清的培养液1mL继续培养18～24h，更换新的100mLL-11640培养基，继续培养24～72h，用含1gL-1G418的完全培养液培养，进行细胞筛选.提取细胞的RNA，以生物素标记核酶的cDNA链作为探针，进行斑点杂交检测细胞内转录情况.用四唑盐比色试验检测细胞活力，参照文献［4］进行.细胞端粒酶活性检测参照端粒酶TRAP-HybKit说明书进行.样本A490nm值大于或等于阴性对照A490nm值的2.1倍时，为端粒酶活性阳性.阴性对照为同体积裂解液加入反应.收集转染后第

5、3代细胞（5×105），1000rmin-1离心10min，0.01molL-1，pH7.3PBS洗1次，加入1mL-20℃预冷的700mLL-1乙醇固定，4℃过夜.次日用0.01molL-1PBS洗1次，加入PI300μL染色30min，在ELITE-流式细胞仪上测定细胞周期.统计学方法:μ检验.2结果HO-8910/pRZ细胞斑点杂交显示转染成功（Fig1）.细胞活力检测结果表明试验组细胞的潜伏期及对数生长期分别为72h及5d，对照组为48h及4d.实验组细胞的潜伏期延长，对数生长期明显减慢（Fig2）.各组细胞A490nm值分别为:阴性对照0.056，阳性对照0.119，HO

6、-8910/pRZ细胞0.105，HO-8910/pcDNA细胞0.141，HO-8910细胞0.163.分别为阴性对照的1，2.13，1.88，2.52及2.91倍，结果判定分别为:HO-8910/pRZ细胞为阴性，HO-8910/pcDNA细胞及HO-8910细胞为阳性.HO-8910/pRZ细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，转染空载体的细胞（HO-8910/pcDNA3）端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显.流式细胞仪检测结果表明HO-8910/pcDNA3细胞中处于G1期，S期的细胞比例分别为70.0%和19.0%，HO-8910/pRZ细胞分别为80.5%和13.7%.

7、核酶作用后，G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低（P0.01）.细胞的分裂、增殖受到明显抑制.图1－图2略3讨论核酶为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段［4］.Duggan等［5］报告，端粒酶阳性预测肿瘤细胞存在的敏感率达88%.Novakovic等［6］检测卵巢癌端粒酶RNA敏感率为71.4%.抑制端粒酶的活性成为治疗肿瘤的可能途径，Du等［7］通过端粒酶催化亚单位（hTERT）基因的反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞的端粒酶活性;Z