sv40大t抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响论文

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1、SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响论文王新文，金岩，刘源，王军琳，赵宇，董蕊【关键词】大T抗原【Abstract】AIM：ToinvestigatetheroleofSV40largeT(LT)antigenonhumanskinfibroblaststransformationandtoobservethebiologicalalterationofthecells.METHODS：Humanskinfirbroblastsidpsv3neoRNAandphenotypicalchangesofthetransformantsined.RESULT

2、S：LTcDNAtransformedcellcoloniesRNAexpressedinmosttransformedcellsinedbyinsituhybridization.Afteraperiodoftime,hoalhumanskinfibroblastsimmortalizedislimited.SoitisimpossibletoestablishimmortalizedhumanskinfibroblastcelllineonlybylargeT.【KeyRNA在转染细胞胞质中表达.免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达.细胞计数、Brd

3、U、流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡.结论:LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡.所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式.【关键词】SV40；大T抗原；皮肤；成纤维细胞0引言成纤维细胞是皮肤真皮部分的主要细胞成分，对皮肤起营养、支持和免疫作用.皮肤成纤维细胞作为正常体细胞的一种，生命期有限，通常在40代左右即出现衰老［１］，继而增殖缓慢，逐渐死亡.LTcDNA的转染一直是非造血细胞永生化最常

4、用的方法.为获得性状稳定、能够长期培养的皮肤成纤维细胞，更好地满足基础研究和相关疾病的治疗，我们准备利用LT能使细胞向永生化趋势转变的特点，应用基因转染技术，研究LT对人皮肤成纤维细胞体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变.1材料和方法1.1材料含有LTcDNA的质粒(psv3neo由Berg教授惠赠),皮肤组织(流产胎儿背部),DMEM培养基、胎牛血清(Gibco),LipofectAMINE2000Reagent转染试剂盒(Invitrogen),Biotek凝胶回收试剂盒(Omega),原位杂交标记和检测试剂盒(BoehringerMannheim),SV

5、40大T抗原抗体(SantaCruz),免疫组化检测试剂盒(DAKO),BrdU检测试剂盒(Sigma),.freelega).1.2方法1.2.1细胞培养参照鄂征［２］所描述的方法，将真皮成纤维细胞制成细胞悬液后，离心.用含有100mＬL-1胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，按（2～4）×107L-1细胞密度将成纤维细胞接种到上述培养基中.12h后换1次液体，以后3d换1次液体，观察细胞形态.细胞长到80%后，用2.5gL-1胰酶消化，按14传代.1.2.2质粒转染及细胞克隆的分离将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种到6孔板，每孔细胞数为2×105.次日进行转染（

6、转染过程按说明书进行）.转染后培养24h，细胞接近汇合时，按110密度传代，继续培养.待密度接近50％-70％时，加0.4gL-1的G418进行筛选，未转染细胞作为对照.6d后，对照细胞全部死亡，将筛选液浓度降至0.2gL-1，2~3RNA表达检测EcoRⅠ／PvuⅡ双酶切质粒psv3neo后，10gL-1琼脂糖凝胶电泳后，分离片段，用凝胶回收试剂盒，获得4.8kb大小的LTcDNA，用随机引物法对该片段进行标记.取转染后第3代和第16代细胞爬片，进行原位杂交，检测LTmRNA的表达情况.正常细胞作为阴性对照.1.2.4SV40大T抗原检测取转染后第3代细胞爬片，利

7、用免疫组化SABC法进行SV40大T抗原表达检测.步骤按说明书进行.1.2.5细胞生长曲线分别取第3，19，32代未转染细胞和转染后第3，16代细胞，按1×103cm-2的密度接种到24孔板，隔日进行细胞计数.分别取３个孔，取平均数.连续检测5次,绘制细胞生长曲线.1.2.6BrdU检测分别取第3，19，32代未转染细胞和转染后第3，16代细胞.实验前1d接种细胞到放有玻片的培养板中，持续培养，到细胞密度50％-80％时，吸弃培养液，加入含1mLL-1BrdU的培养液，继续培养4h，取出细胞爬片用抗－BrdUmAb检测，每一组取10个标本进行阳性细胞计数,组间进