靶向于her2的sirna表达载体在人乳腺癌细胞skbr3中的表达论文

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1、靶向于HER2的siRNA表达载体在人乳腺癌细胞SKBr3中的表达论文鲍炜张立红付海京贾林涛张勇刘家云任新玲温伟红孟艳玲王成济杨安钢【摘要】目的：探讨针对HER2分子的RNA干涉对乳腺癌细胞生长的影响.方法：人工合成DNA，经退火磷酸化后克隆入pSUPER载体.基因转染后通过观察细胞形态和细胞计数等方法验证发夹状小干涉RNA(siRNA)对细胞生长状态的影响，以激光共聚焦检测基因表达情况.结果：siRNA表达载体转染后可以引起SKBr3细胞大量死亡，间接免疫荧光检测出HER2蛋白表达降低.结论：针对HER2进行RNA干涉可在体外抑制SKBr3细胞生长.【关键词】HER2；R

2、NA干涉；基因治疗【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofHER2targetedRNAinterference(RNAi)onthegroanbreastcarcinomaSKBr3cells.METHODS:HER2targetedhairpinsmallinterferingRNA(siRNA)genesentarysinglestrandDNAs.pSUPERvectorharboringeachoftheabovegenesinedbyRTPCRandindirectimmunofluorescenceassay,andth

3、eeffectoftheHER2targetedsiRNAoncellgroorphologicalobservation.RESULTS:BothRTPCRandindirectimmunofluorescenceassayrevealedaremarkabledecreaseofHER2expressioninpSUPERsihe1andpSUPERsihe2transfectedcells,butnotinpSUPERvectortransfectedcells.Cellproliferationaticallyinhibitedaftertheexpress

4、ionoftheHER2targetedsiRNAsasshoicroscopicobservationandcellcounting.CONCLUSION:HER2targetedRNAiinSKBr3cellscaneffectivelyinhibittheexpressionofHER2geneandtheproliferationofthecellsinvitro.【Keyab问世.freelpus公司）；AlphaImagerTM1220凝胶成像系统（AlphaInnotech公司）；SUNRISE酶标仪（澳大利亚TECAN公司）；PE2400PCR仪（美国Pe

5、rkinElmer公司）；5417R台式低温冷冻离心机、5415DCentrifuge台式高速离心机（德国Eppendorf公司）.1.2方法1.2.1以HER2为靶分子的siRNA的设计及真核表达载体的构建根据人HER2基因设计4条寡聚脱氧核苷酸链（oligo）,序列为:oligo1:5′gatcccctgatagacaccaaccgctcttcaagagagagcggttggtgtctatcatttttggaaa3′；oligo2:5′agcttttccaaaaatgatagacaccaaccgctctctcttgaagagcggttggtgtctatcaggg3′

6、；oligo3:5′gatcccctgaaacctgacctctcctattcaagagataggagaggtcaggtttcatttttggaaa3′；oligo4:5′agcttttccaaaaatgaaacctgacctctcctatctcttgaataggagaggtcaggtttcaggg3′.由赛百盛公司合成.取两条DNA在退火缓冲液中退火，95℃4min，70℃10min，缓慢降温到4℃.退火缓冲液组分为：100mmol/L醋酸钾，30mmol/LHEPESKOH,2mmol/L醋酸镁.取退火后的产物磷酸化，产物与经HindIII和BglII双酶切的pS

7、UPER载体进行连接，连接产物命名为pSUPERsihe1,pSUPERsihe2,转化E.coliDH5α菌株，挑阳性克隆酶切鉴定，测序.1.2.2真核表达载体的细胞转染转染前24h将SKBr3细胞分别铺于6孔板，待细胞生长至约60%汇合时，按照lipofectAMIM2000使用说明转染pSUPERsiRNA及pSUPER空载体.倒置显微镜观察细胞状态.1.2.3RTPCR检测HER2的表达RNA的提取按试剂盒说明书操作进行，模板总量5μg,反转录酶16.67nkat,0.5μ