球状细菌纤维素的制备文献综述

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文献综述球状细菌纤维素的制备一、摘要:通过对细菌纤维素的的X-射线衍射图谱和固体CP/MAS13C-NMR谱分析,表明细菌纤维素结晶度高,Iα/Iβ比例大。对细菌纤维素干膜进行渗透性实验,发现干膜透气性小,透湿性大,结构致密,含有大量极性基团。关键词:细菌纤维素,结构,性质二、前言1886年,A.J.Brown[1]就首次报告了由木醋杆菌(Acetobacterxylinum)能够合成一种胞外凝胶状的物质,但由于无合适的实验手段以及纤维素的产量较低,因此一直未受到足够重视。细菌纤维素是由纯的D-葡萄糖聚合而成,纯度极高,不掺杂其它多糖[2]。细菌纤维素引起人们更多的注意还在20世纪后期,使用A.xylinum作为一种模型细菌,深入研究细菌纤维素合成是从Hestrin等开始的,他证明了静止和冻干的醋酸细菌细胞在有葡萄糖和氧时能够合成纤维素;Colvin在含A.xylinum细胞抽提物,葡萄糖和ATP样品中观察到有纤维素的合成。细菌纤维素属于初级代谢的特殊产物,与植物纤维素(PC)一样,细菌纤维素主要也是起到一种保护层的作用。能够产生细菌纤维素的细菌主要有Acetobacter,Rhizobium,Agrobacterium和Sarcina等。细菌纤维素产生菌中研究最多、产量最高的细菌是产醋酸的Acetobacterxylinum,为革兰氏阴性,宽0.6~0.8um,长1.0~4.0um,以单个、成对或链状存在,菌落呈圆形,不透明,突起,淡棕色,表面粗糙,为好氧型,它已被作为细菌纤维素基础和应用研究的模式微生物[3]。细菌纤维素和植物纤维素在基本结构上,都可视为由吡喃葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接而成的直链多糖,又称为β-1,4萄聚糖,相邻的吡喃葡萄糖的6个碳原子并不在同平面上,而是呈稳定的椅状立体结构,在高等植物的二级细胞壁中,聚合度约为7000-14000,而一级细胞壁则仅为500个左右的聚合度,直链多糖的长度与单体数目多寡无关。数个邻近的β-1,4葡聚糖链由分子链内与链间氢键稳定结构而形成不溶于水的聚合物(c),细菌纤维素与植物纤维素的主要差别在于前者不掺杂有其它多糖,如半纤维素或木质素,而后者则含有此类物质[4]。天然纤维素可分为Ⅰ型和Ⅱ型,由X-射线分析,醋酸菌所产生的纤维素属于Ⅰ型。醋酸菌所产生的纤维素并非形成细胞壁的一部分,而是由位于细胞壁上约有50-80个孔往外分泌纤维素,先由10-15条直链多糖聚合成1.5nm的胶状聚合物,然后再由上述聚合物形成走向与菌体长轴平行的纤维束。醋酸纤维素以2μm/min的速率进行纤维素束的合成。如醋酸纤维素的单体数随培养时间而有所不同,初期约含2000个单体,而到稳定期可达到4000个单体。三、球状细菌纤维素的制备方法通过木醋杆菌的利用有两种培养的方法可以合成细胞外纤维素。一种是静态的培养,在空气和液体介质接口之间用于创建凝胶状纤维素膜。另一种是动态的培养。合成的纤维素分布在整个纤维结构的形式。2.1 菌种分离方法 使用0.9%生理盐水配制10mL菌悬液,稀释1000倍,吸取0.1mL稀释液于平板的固体培养基上涂布平板。倒置在恒温培养箱中,28℃培养7d。挑选直径较大,表面光滑湿润的单菌落接入斜面培养基中,28℃下培养3d,然后接入100mL种子培养基中,按照1.2.2的培养方法进行发酵。2.2 培养方法动态培养:种子培养液中接入斜面菌种后于28℃、150r/min摇床中培养48h,按10%接种量接种于50mL发酵培养液,28℃,150r/min振荡培养7d。静态培养:种子培养液中接入斜面菌种后于28℃,150r/min摇床中培养4h,按10%接种量接种于50mL发酵培养液,28℃培养箱中静置培养。由木醋杆菌(Acetobacterxylinum)X-2[5]发酵生成的细菌纤维素膜浮于液面。膜取出后,用水多次冲洗,除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于80℃的0.1mol/LNaOH溶液,保温2h,除去液膜中的菌体和残留培养基,膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗至中性。将膜在4000r/min下离心40min,所得膜定义为细菌纤维素湿膜。将膜置于50-60℃干燥2-3h,注意保持膜平整,所得膜定义为细菌纤维素干膜。将膜置于105±3℃恒重,测细菌纤维素绝干重。2.3细菌纤维素的酶法水解分别取2g只用水煮除杂质的细菌纤维素湿膜,2g经碱处理的细菌纤维素湿膜和0.2g经碱处理的细菌纤维素干膜,切碎后,分别加入20mL蒸馏水,用盐酸调pH值至4.8后,分别加入酸性纤维素酶[5000单位/克(细菌纤维素)],40℃水解24h,滤纸过滤取滤液进行纸层析。2.4X-射线衍射分析X-射线衍射仪(日本理学株式会社D/max-250),测试条件:厚度24μm的细菌纤维素干膜平整固定在框架上,Cu靶,10kV高压,管流100mA,进行2q=0-400大范围扫描。2.5固体CP/MAS13C-NMR分析Solid-stateCP/MAS13C-NMR(VarianUNITYplus400),细菌纤维素干膜切碎、研磨后测定[6]。2.6透气性GTR(GasTransportRate)[mL/(atm·d·m2)]细菌纤维素干膜试样为148.78mg,膜厚0.022mm,膜直径为90mm。对照样选用厚度相同的PVC(聚氯乙烯)膜和LDPE(低密度聚乙烯)膜。所有试样在无水CaCl2干燥器中干燥24h。实验温度为22℃,高压侧压力为760mmHg,低压侧压力为1×10-2-1×10-3mmHg。测试气体为氧气[7]。2.7透湿性VTR(VaporTransportRate)[g/(m2·d)]细菌纤维素干膜试样为151.3mg,膜厚0.022mm,直径为90mm。对照样同透气性测试。实验温度为35±0.5℃,相对湿度RH为100%。试样上方空气流速为0.5-2.5m/s。四、球状细菌纤维素的研究方法3.1细菌纤维素结构分析3.1.1X-射线衍射分析纤维素X-射线衍射图谱是以衍射角为横坐标,衍射强度为纵坐标,以晶胞(101),(101)和(002)面的衍射峰为计算基准,其它位置的衍射峰与结晶度计算关系不大[8]。细菌纤维素(BC)膜在0.1mol/LNaOH溶液80℃处理1h,经50℃干燥后所得样品的衍射图(图4)有三个衍射峰(peak1,2,3)(表1)。整条曲线与JoseD.Fontana[9]报道的BC经蒸馏水处理后的样品实验值很相似(表1)。除衍射图的强度(intensities)稍有不同外,衍射曲线与KunikioWatanabe[7]报道的BC经0.1mol/LNaOH溶液在80℃处理20min后的样品实验值相似。 图四细菌纤维素的X-射线衍射图图五细菌纤维素的CP/MAS13C-NMR谱3.1.2固体CP/MAS13C-NMR分析本实验所得细菌纤维素的固体CP/MASC-NMR谱(图5)及4个主要峰的化学位移δ与JoseD.Fontana[10]及KunihiloWatanabe[11]报道的相似(表2)。经X-射线衍射曲线和CP/MASCNMR谱分析,可确定A.XylinumX-2静态培养产生的表面液膜是细菌纤维素。 表1细菌纤维素的X-射线衍射的峰值峰本实验Fontana[12]2θD值密度I/I02θD值114.566,08580810014.506.09216.605.3413582316.80322.643.9257609922.763.90BC的预处理蒸馏水清洗,然后在80℃,0.1mol/LNaOH溶液中浸泡1小时,再用蒸馏水清洗只用蒸馏水清洗表2细菌纤维素CP/MASC-NMR谱的化学位移δ峰δ/ppm对应峰(图五)本实验Fontana1105.1105.6C1288.889.6C4374.5,71.275.172.0C2.3.5465.266.1C63.2细菌纤维素干膜渗透性能由于聚合材料存在分子间空隙、针孔缺陷或气孔,或者是有二、三种形式同时存在,聚合材料不能阻挡住气体和蒸汽分子的渗透[13]。实验中,将“渗透”严格地限于气体和蒸汽分子通过分子般大小空隙的运动。通常测定的渗透量,对于氧气,以标准温度和大气压下的体积计;对于水蒸汽,以质量计。表3细菌纤维素干膜的渗透性能渗透性细菌纤维素干膜PVC膜PE膜GTR(O2)[ml/(atm·d·m2)]49918202900VTR(H2O)[g/(m2·24h)180159.447.6从GTR值的大小(表3)可知,PE膜的透气性最大,PVC膜次之,细菌纤维素干膜的透气性最小。从VTR值的大小可知,细菌纤维素干膜的透湿性最大,PVC膜次之,PE膜最小。聚合材料的渗透性受其本质的影响[14],包括化学结构和物理结构,如分子中有无极性基团,分子间力的大小,结晶度,定向度和交联度等。通常极性渗透物对极性薄膜,非极性渗透物对非极性薄膜易于渗透[15]。无定形的PVC对于非极性氧气的透过系数小于具有一定结晶度的非极性PE。纤维素是极性大分子聚合物,干膜结构致密,聚合度高,分子直径为0.298nm的氧气难以透过。但水蒸汽的分子直径为0.4nm,却比直径更小氧气易于透过细菌纤维素干膜,这是因为纤维素分子链中含亲水基团-OH,分布着氢键体系,易于吸水,吸水性大,透湿性也大[16]。纤维素大分子和水分子相互作用发生在纤维素的不定形区[。吸收的水减弱纤维素的氢键体系,使纤维素产生润胀作用,将大分子聚合物转变成更松散的状态。这是因为增加了链段流动性,增加了自由体积[17]。实验发现,水分子和纤维素形成的氢键,不仅涉及到纤维素的羟基,还有纤维二糖的连接氧桥O4和葡萄糖残基吡喃环的氧O5。因此,水分子和纤维素复合物的形成过程中发生了电荷转移,纤维二糖是电子密度的供体。由于水和纤维素的氢键产生的诱导效应及电子密度的非定域作用,导致纤维素链段的流动性[18]。纤维素润胀后,其内聚力下降,内部变得柔软可塑。 五、总结细菌纤维素作为一种极具应用潜力的生物学材料,虽然人们发现的较早,但对其功能特性的研究仅十年左右,因此,我们应从分子生物学的角度对其加以深入研究,进一步明确其生成和作用机理,拓展其新的应用领域。目前,我们国内对细菌纤维素的研究仅仅停留在实验室水平,与国外特别是日本的差距还较大,目前的技术障碍主要是发酵水平较低,还不能真正达到产业化,因此,我们应采用基因工程和高密度培养等手段来提高细菌纤维素的合成效率,同时应加强细菌纤维素合成的动力学研究,设计合理的生物反应器,早日实现细菌纤维素在我国的商品化。六、参考文献[1]PeterRoss,RaphaelMayer,MosheBenziman.Cellulosebiosynthesisandfunctioninbacteria.MicrobiologicalReviews,1991,55(1):35~58[2]贾士儒,欧竑宇,傅强.新的生物材料——细菌纤维素.食品与发酵工业,2001,27(1):54~58[3]贾士儒,齐英,陈贵斌等.生产细菌纤维素的葡萄糖氧化杆菌的初步研究.第二届全国发酵工程学术讨论会论文集.无锡,1998.153~156[4]欧竑宇.细菌纤维素培养基优化及其应用研究.天津轻工业学院硕士论文,2000-12[5]陈嘉翔.制浆化学.北京:中国轻工业出版社,1990[6]JoseDFontana,CassandraGJoerke,MadalenaBaron,etal.Acetobactercellulosicbiofilmssearchfornewmodulatorsofcellulogenesisandnativemembranetreatments.AppliedBiochemistryandBiotechnology,1997,63~65:327~338[7]KunihikoWatanabe,MariTarbchi,YasushiMorinaga,etal.Strueturalfeaturesandpropertiesofbacterialcelluloseproducedinagitatedculture.Cellulose,1998,5:187~200[8]GRBrown主编.林明宝等译.塑料测试方法手册.上海:上海科学技术出版社,1994.497~516[9]倪德良,张其晖.塑料特性与选用.上海:华东理工大学出版社,1994.342~348[10]NPNovosjolov,ElenaSSachina.CellulosestructuralpeculiaritiesandthemechanismofdissolutionintertiaryamineN-oxides.CelluloseChemistryandTechnology,1999,33:361~380[11]SYnamanaka,KWatanabe,NKitamura.Thestructureandmechanicalpropertiesofsheetspreparedfrombacterialcellulose.JMaterSci,1989,24:3141~3145[12]HaiglerCH,BenzimanM.CelluloseandotherNaturePolymerSystems.NewYork:EdPlenumPress,1982.chap.14[13]RobertE,CannonstevenM,Aderson.BiogenesisofBacterialCellulose.Microbiology,1991,17(6):435~447[14]TonouchiN,TsuchidaT,YoshinagaF,etal.CharacterizationofthebiosyntheticpathwayofcellulosefromglucoseandfructoseinAcetobacterxylinum.BiosciBiotechBiochem,1996,60:1377~1379[15]RossP,WeinhouseH,AloniY,etal.RegulationofcellulosesynthesisinAcetobacterxylinumbycyclicdiguanylicacid.Nature,1987,325:279~281[16]KamideKY,MatsudaH,Iijima,etal.Effectofcultureconditionofaceticacidbacteriaon 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