犬细小病毒vp2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒vp2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文

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1、犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文【摘要】目的表达犬细小病毒vp2蛋白（cpvvp2），用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和vp2蛋白功能研究。方法采用pcr方法对cpvvp2基因进行扩增，将cpvvp2基因克隆到毕赤酵母(pichiapastoris)分泌表达载体ppiczαa中，构建真核重组表达载体ppiczαavp2，将该重组质粒线性化后，转化毕赤酵母菌gs115中，在甲醇诱导下表达cpvvp2，sdspage和ing2，caozhen2，edicineofch

2、ineseagricultureuniversity，beijing100094；2.nationalveterinarydiagnosticcenterofministryofagriculture，beijing100094，china)【abstract】objectivetoestablishayeastpichiapastorisexpressionsystemexpressingcanineparvovirusvp2protein(cpvvp2)toservethediagnosisofcpv，developmentofcp

3、vvaccineandresearchofvp2proteinfunction.methodscpvvp2geneplifiedbypcr，clonedintosecretorypichiapastorisexpressionvectorppiczαa，andedppiczαavp2.afterbeinglinearizededigestion，thevectoredintopichiapastorisgs115byelectroporationmethod.thecpvvp2proteinexpressedethanolinduct

4、ion.theexpressedproteininyeastplified，sdspageandagainstcpv.conclusioncpvvp2hasbeensuccessfullyexpressedinyeastpichiapastoris.theexpressedcpvvp2proteinsharesreactionagainstcpv.【key109感受态细胞购自promega公司，c表达载体ppiczαa、毕赤酵母gs115菌株及抗生素zeocintm购自invitrogen公司。1.1.2主要试剂、试剂盒及培养基：限制

5、性内切酶ecorⅰ、xbaⅰ、sacⅰ、dnamaker购自大连宝生物技术有限公司；taqdnapolymerase、dntp、t4dna连接酶购自promega公司。小量胶回收试剂盒、酵母基因组dna提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司，质粒纯化试剂盒购自博大泰克公司，低盐lb、ypd、mdh、mmh、bmgy、bmmy等培养基均按照invitrogen公司毕赤酵母表达说明书配制［2］。辣根过氧化酶标记羊抗犬酶标二抗购自中杉公司。1.1.2引物:根据已发表的cpv的vp2基因dna序列，利用primer5.0软件设计一对引物，上游引物中

6、含有ecori限制性酶切位点，下游引物中含有xbai限制性酶切位点，重组表达质粒的pcr鉴定所用引物根据表达载体ppiczαa上的5′aox1和3′aox1引物位点合成，引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物vp2f：5′gcgaattcatgagtgatggagcagtt3′;下游引物vp2r：5′actctagatataattttctaggtgc3′;pcr鉴定引物：5′aox1：5′gactggttccaattgacaagc3′;3′aox1：5′gcaaatggcattctgacatcc3′;使

7、用液浓度为10pmol/μl。1.2方法1.2.1cpvdna的提取：采用酚氯仿异戊醇方法提取病毒dna，沉淀用50μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。1.2.2pcr扩增vp2基因：以上步提取的dna为模板，利用特异性引物vp2f/vp2r扩增vp2基因。pcr反应体系20μl：ddh2o8μl，10×pcrbuffer2μl，2.5mmol/ldntp2μl，15mmol/lmg2+2μl，10pmol/μl目的基因上下游引物混合液2μl，0.5u/μltaqdna聚合酶2μl，cpvdna模板2μl。反应条件为95℃预变性8mi

8、n；94℃变性2min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。95℃预变性8min后立即加入taqdna酶。pcr产物在1%琼脂糖凝胶中电泳。1.2.3表达载体ppic