慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

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1、慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究【摘要】目的：分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法：采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果：分离培养出人骨髓来源的MSCs，并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论：获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰，为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。【关键词】间质干细胞;慢病毒;转染　　〔Ab

2、stract〕Objective:Toisolateandculturemesenchymalstemcells（MSCs）derivedfromhumanbonemarroethodhumanbonemarroine2000.Results：Humanbonemarroanbonemarroesenchymalstemcells；lentiviralvector;transfection　　间质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝

3、脏、脐血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源。MSCs增殖能力强，体内外均具有多向分化潜能，基因修饰后保持原有多潜能性的同时可持续稳定表达外源基因；体外转染和培养一段时间移植至体内仍可存活，并能够迁移至病变部位,因而其成为基因治疗研究领域令人关注的靶细胞〔1〕。因此，本研究从人骨髓组织中分离培养出MSCs并体外扩增用于慢病毒转染，为进一步利用MSCs进行基因治疗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1标本和主要试剂　　成人骨髓（江苏大学附属医院），慢病毒三质粒系统FUGVR-delta8.

4、9和VSVG（上海医学遗传所惠赠），人胚肾293T（本实验室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Toyobo公司），PCR试剂（Takara公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB公司）。引物设计采用primerpremier5.0软件，由上海

5、生物工程有限公司合成。　　1.2主要仪器　　二氧化碳培养箱（Forma公司），BeckmanSSCs的分离扩增根据本室建立的方法分离培养人骨髓MSCs〔2〕。主要操作如下：新鲜分离的骨髓液5ml加入含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，用吸管吹打混匀后，800r/min离心10min去除含脂滴上清。细胞沉淀种在含10%胎牛血清的L-DMEM营养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养。5d后半量换液,第7～10天后见有较多贴壁细胞后全量换液，此后每3天换液1次。细胞80%左右融合时,用含0.1mmolEDTA-N

6、a2的0.25%胰酶室温消化,细胞沉淀按1∶3比例传代。待其生长接近融合层时，即得到人骨髓来源的MSCs。　　1.3.2人骨髓MSCs表面标志检测取1×105第3代人骨髓MSCs与FITC或PE标记的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30min后，经流式细胞仪检测。阴性对照为FITC结合的鼠IgG1和PE结合的鼠IgG1。　　1.3.3慢病毒包装在包装前1天种植293T细胞，10cm盘中细胞密度为6×105个细胞/盘，含10%FBS的L-

7、DMEM10ml/盘培养过夜。第2天转染前换成无血清培养液，然后将15μgFUGVR-delta8.9，9μg包膜质粒VSVG用无血清培养液稀释至1.5ml，同时将30μl的lipofectamine2000脂质体复合物稀释至1.5ml，室温静置5min后将脂质体复合物加至质粒复合物中，混匀后室温静置15min。将上述混合体系加入293T细胞中，8～16h后换成含10%FBS的L-DMEM，每盘10ml，37℃、5％CO2培养。48～72h后收集病毒上清，1000r/min离心15min去除细胞碎片后，1

8、5000r/min，4℃超速离心2h浓缩病毒，用无血清培养液溶解病毒沉淀后分装保存于-70℃低温冰箱。　　1.3.4慢病毒滴度测定滴度测定前1天种293T细胞，6孔板中细胞密度为5×104个细胞/孔，含10%FBS的L-DMEM为2ml/孔，第2天取1μl浓缩病毒液加入事先种好的细胞中，加入终浓度为8μg/ml的Polybrene置培养体系中以提高感染效率。37℃、5%CO2培养箱培养，1周后用流式细胞仪检测阳性率。滴度计算公