心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴

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1、心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴关键词】心潘国栋黄永章，郭凌郧，唐俊明，孔霞，YANGQinglin，王家宁肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞[摘要]目的：构建并鉴定心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体（MHC-EGFP），该基因只在心肌中特异性表达。方法：设计5’和3’分别具有SalI/HindⅢ酶切位点的EGFP引物，聚合酶链反应法（PCR）从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的cDNA，插入pGEM-TEasy载体表达盒，构建pGEM-EGFP，SalI/HindⅢ双酶切后

2、回收729kb片断，插入经相同酶切的含5.5kb心肌特异性α肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒，构建pMHC-EGFP。连接产物转化感受态DH5α，挑选克隆，PCR扩增鉴定，重组质粒经NotI酶切，回收7.2kbMHC-EGFP表达盒。分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性。结果：EGFPcDNA正确插入pNC26质粒中αMHC启动子3’端。成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细

3、胞无荧光出现。结论：MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础。[关键词]心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞Abstract:ObjectiveToconstructandidentifythecardiac-myosinheavychainpromoter(MHC)-drivenenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)expressionvector(pMHC-EGFP),yocytes.MethodsEGFPcDNAprimerserandreversep

4、rimercontainingSalIandHindⅢ,respectively.EGFPcDNAplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),addedsingledeoxyadenosineat3’ends,andsubclonedintopGEM-TeasyvectortoconstructpGEM-EGFP.Thefragmentof729bpfromSalI/HindⅢ-digestedpGEM-EGFPidcarried5.5kbMHCpromoter,toconstructpMHC-EGFP.Theexpression

5、cassetteof7.2kbMHC-EGFPeltingpointagaroseelectrophoresis.Mousecardiomyocytesandskeletalmusclemyoblastsyocytesandmyoblasts,respectively.EGFPexpressionicroscope.ResultsEGFPcDNAoter.Thegreenfluorescencecouldbeobservedintransfectedcardiomyocytes,butnotintransfectedmyoblasts.ConclusionMHC

6、-EGFPexpressioncassettecanbespecificallyexpressedyocytes,onitorthedifferentiationofstemcellsintocardiomyocytes.Keyoter;Enhancedgreenfluorescentprotein;Stemcells　近年来日益兴起的大量干细胞研究证实，胚胎或成体间充质干细胞在一定条件下可以分化为心肌样细胞，为心脏疾病的治疗带来了希望。然而这些心肌样分化的干细胞是否具有成年心肌的收缩和传导功能，目前研究还相当缺乏。这是因为通过免疫组织化学或细胞化学染色判断干细

7、胞分化，需要先对细胞进行固定处理，不能在活细胞状态下观察干细胞的心肌分化。本研究将心肌特异性α肌球蛋白重链（alpha-myosinheavychain,MHC）启动子与增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）连接，构建在心肌中特异表达的报告基因系统，使之用于在活细胞状态下观测判断干细胞的心肌分化，为深入进行干细胞的心肌分化研究奠定基础。1材料与方法1.1材料限制性内切酶SalI、HindⅢ、NotI以及200bpDNAladder和LambdaDNA/HindⅢmarkers购自华美生物工程公司；Taq聚合

8、酶、T4DNA连接酶、d