高粱ssr标记筛选及pcr反应程序优化

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1、高粱SSR标记筛选及PCR反应程序优化摘要：以ＢＪ－２９９、Ｔｘ６２２Ｂ、Ｗ４５６、忻粱５２和Ｒｏｍａ５个高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ］品种的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增以筛选ＳＳＲ分子标记引物。设计不同的退火温度和扩增程序，对２５０对ＳＳＲ引物进行筛选和反应程序的优化。结果表明，２５０对ＳＳＲ引物中有２２３对引物扩增成功，大部分引物的退火温度为５５～５７℃，共筛选出１２５对在耐盐碱品种ＢＪ－２９９与盐碱敏感品种Ｔｘ６２２Ｂ间表现出多态性的ＳＳＲ引物。关键词：高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ］；ＳＳＲ；ＰＣＲ；

2、引物筛选中图分类号：Ｓ５１４；Ｑ９４３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）17－3869-03TheＳｃｒｅｅｎｉｎｇofＳＳＲＭａｒｋｅｒｓｆｏｒＳｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰＣＲＰｒｏｃｅｄｕｒｅＨＡＮＹｕｎ，ＧＡＯＪｉａｎ－ｍｉｎｇ，ＳＵＮＳｈｏｕ－ｊｕｎ，ＰＥＩＺｈｏｎｇ－ｙｏｕ，ＬＵＯＦｅｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，5ＴｉａｎｊｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆ５Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏ

3、ｌｏｒｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ＢＪ－２９９，Ｔｘ６２２Ｂ，Ｗ４５６，Ｘｉｎｌｉａｎｇ５２ａｎｄＲｏｍａ，ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｅｍｐｌａｔｅｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ．Ｂｙａｄｊｕｓｔｉｎｇｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，２２３ｏｕｔｏｆ２５０ｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｏｆｗｈｉｃｈｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅwasｍｏｓｔｌｙ５５～５７℃．１２５ＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｓｈｏｗｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｂｅｔｗｅ

4、ｅｎｓａｌｉｎｅａｌｋａｌｉｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｙＢＪ－２９９ａｎｄｓａｌｉｎｅａｌｋａｌｉｓｅｎｓｉｔｉｖｅｖａｒｉｅｔｙＴｘ６２２Ｂ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ；ＳＳＲ；ＰＣＲ；ｐｒｉｍｅｒ5ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ近年来，分子标记技术已被广泛应用于动植物基因组和遗传育种等的研究，成为现代分子生物学和遗传学发展的主流［１］。其中ＳＳＲ标记技术具有易于操作、技术简便、重复性和稳定性好等特点，目前在玉米、水稻、大豆和小麦等作物的遗传连锁图谱构建［２－５］、品种鉴定［６］、种子纯度检测［７］、基因定位［８－１１］、遗传差

5、异和多样性研究［１２－１６］等方面得到了广泛应用。高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ］是世界上第五大禾谷类作物［１７］，可作为粮食作物及动物饲料。ＳＳＲ分子标记在高粱的遗传育种等研究中已有广泛的应用［１８，１９］。Ｌｉ等［２０］已经在高粱１０条染色体上物理定位了１６９２个ＳＳＲ标记；Ｍｅｎｚ等［２１］通过物理定位和遗传定位在高粱的１０条染色体上定位了２０２个ＳＳＲ标记，这些ＳＳＲ标记为高粱的遗传改良研究奠定了基础。然而这些已报道的ＳＳＲ的ＰＣＲ反应条件不一样，因此有必要建立高效通用的ＳＳＲ反应体系，以提高分析效率。本研究对高粱ＳＳＲ－ＰＣＲ反

6、应条件进行优化并进行了ＳＳＲ引物的筛选，以期为高粱种质资源遗传结构分析和重要农艺性状的ＱＴＬ定位奠定基础。１材料与方法１．１材料5实验选用３个甜高粱品种Ｗ４５６、Ｒｏｍａ和ＢＪ－２９９（耐盐碱品种）、１个粒用高粱品种忻粱５２及１个保持系Ｔｘ６２２Ｂ（盐碱敏感品种），均由天津农学院作物遗传育种重点实验室提供。２００９年将这些高粱种植于天津农学院实验田，在植株拔节期前后取各单株叶片，液氮速冻后保存于－８０℃超低温冰箱中备用。１．２实验方法１．２．１基因组ＤＮＡ的提取采用改良的ＣＴＡＢ法从高粱叶片中提取基因组ＤＮＡ［２２］，使用０．８％琼脂糖凝胶电泳检测所提ＤＮＡ的数

7、量与质量，将浓度调整一致后于－２０℃贮存备用。１．２．２ＳＳＲ引物的选择采用Ｐｒｅｍｉｅｒ５软件对已报道的ＳＳＲ引物的退火温度等参数进行计算，首先保留退火温度为５５～６５℃、ＧＣ含量为４０％～６０％和目标片段长度不小于１２０ｂｐ的引物，然后在保证遗传距离比较均匀的前提下，选择等位基因数目多、其他参数较优的引物，共挑选了２５０对引物用于本实验，其染色体分布及平均物理距离列于表１。引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为１５μＬ，包括５ｎｇ／μＬ的ＤＮＡ模板４μＬ、５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．１μＬ、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１．５μＬ、０．７５μｍｏｌ

8、／Ｌ正反向引物各６μＬ、