冰冻切片实验步骤

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1、全部实验步骤1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时230%蔗糖脱水48小时以上3-250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗？？？冰冻切片不能用热修复啊！！！以下是我的步骤：1冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％

2、过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。25~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。3PBS冲洗，5分钟×3次。4滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。6PBS冲洗，5分钟×3次。7显色剂显色（DAB）。8自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温

3、20分钟。此配方不易产生脱片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O21ml，混匀后使用，每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。25~10％正

4、常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。3PBS冲洗，5分钟×3次。4滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。5滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。6PBS冲洗，5分钟×3次。7显色剂显色（DAB或A

5、EC）。8自来水充分冲洗，复染，封片。1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太

6、近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观

7、察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。12.DAB显色

8、，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s