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1、扩增片段长度多态性全血直接扩增结合焦测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性-发表_图文第40卷2012年7月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第7期1037~1042:/DOI10.3724SP.J.1096.2012.11206全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性17刘云龙1陈之遥2,3武海萍2周国华*12,3(中国药科大学生命科学与技术学院,南京210009)23(南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)药理科,南京210093)(华东医学生物技术研究所,南京
2、210002)摘要亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用“HpHBuffer”直接扩增全血模板,仅需1mL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5mL扩增产物和1mL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检17测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为
3、临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5氟尿嘧啶的个体化用药。-关键词亚甲基四氢叶酸还原酶基因;基因分型;全血直接扩增;焦磷酸测序1引言17亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因的编码产物亚甲基四氢叶酸还原酶为叶酸代谢的限速酶,可催化5,10二甲基四氢叶酸向5甲基四氢叶酸的转化。该基因的--677C>T和1298A>C遗传多态性会影响酶活性[1],从而导致一系列反应。MTHFR基因多态性与甲氨喋呤的毒副作用存在显著相关性。研究结果表明
4、,677位突变型患者在使用甲氨喋呤治疗时的毒性反应比野生型患者严重得多[2,3]。MTHFR的多态性也会影响5氟尿嘧啶的临床疗效,677位突变型患者较-野生型患者可取得更好的化疗结果,1298位突变型患者的化疗效率也明显优于野生型患者[2,4]。检测MTHFR基因677C>T和1298A>C多态性可作为化疗疗效和毒副作用的良好预测指标。目前,对于单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)的检测技术主要包括基于等位基因特异性杂交的Taqman探针技术[5],分子信标技术[6]等;基于核酸内切酶的限制性长度多态性技术[7],
5、引物入侵分析技术[8]等;基于高度特异性DNA连接酶的寡核苷酸连接分析技术[9];基于引物延伸的直接检测中得到应用[11]。焦磷酸测序法[12~14]由于其良好的定量性能,无需电泳或荧光标记,易于自动化等优点已成为SNP检测最主要的方法[15~18]。但是,传统的焦磷酸测序法需要经过DNA提取,PCR扩增,单链制备等前期准备工作,耗时长,且成本测序法和等位基因特异性延伸法[10]等。但这些方法大多操作复杂,成本昂贵,因而没有在大规模SNP较高,难以满足临床检测快速,低成本的要求。本研究利用自主研发的“HpHBuffer”对MTHFR基因进行全血直接扩增[19],省去基因组
6、DNA的提取过程;经过条件优化,仅需要少量PCR产物和微球制备单链就可以完成焦磷酸测序反应,达到对MTHFR基因677C>T和1298A>C两个SNP位点的快速,低成本检测。2实验部分172.1仪器与试剂1024收稿;20120211接受2011----((本文系国家自然科学基金(面上项目)No.20975113)和江苏省科技支撑计划(社会发展)No.BE2010604)资助*Email:ghzhou@nju.edu.cn-;EDC10型基因扩增仪(东胜创新生物科技有限公司)GeneSpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka-;;。Instrument公司)小型
7、焦磷酸测序仪(日本Hitachi公司)GenGenius凝胶电泳成像仪(美国Syngene公司)三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase),单链结合蛋白(Singlestrandedbindingprotein,SSB)和Kle---;now聚合酶为实验室自表达;TaqDNA聚合酶,500bpDNALaddermarker(日本Takara公司)聚乙烯吡;咯烷酮(PVP),QuantiLum?重组荧光素酶(美国Promega公司)腺苷三磷酸双磷酶Apyase,腺-Ⅶ(-Ⅶ)17(1thiotriphosphate),d
