人类淋巴细胞株培养

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1、本科学生综合性实验报告学号姓名学院生命科学学院专业、班级实验课程名称细胞生物学实验教师及职称倪娟（助理实验师）开课学期2011至2012学年上学期填报时间2011年12月1日云南师范大学教务处编印实验序号实验四实验名称人类淋巴细胞株培养实验时间2011.11.3—11.24实验室生物综合实验室21.实验目的（1）能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。（2）熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。（3）熟练掌握细胞传代培养的操作方法。（4）观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。（5）掌

2、握死活细胞的鉴别原理及方法。2.实验原理、实验流程或装置示意图实验原理：（1）传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作（2）清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法

3、。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。（4）细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。（5）氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的

4、细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。（6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从

5、原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。但由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。（7）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。由于许多酸性物质不易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。一．实验设计方案实验流程：一、细胞培养准备工作：（1）

6、洗液的配置：重铬酸钾6.3g加蒸馏水20ml加热充分溶解后冷却再加入浓硫酸100ml充分溶解再倒入洗液缸（2）玻璃器皿清洗干燥酸性洗液浸泡过夜清洗干燥包装消毒灭菌备用（3）胶塞清洗干燥包装消毒灭菌备用二、培养基的配制：配置RPMI1640培养液加酚红通入CO2超净台中过滤除菌按一定比例加小牛血清、谷氨酰胺和双抗溶液三、细胞传代培养：超净工作台中取8ml生长培养基到自己的细胞培养瓶中接种适量细胞悬液旋上盖子放入二氧化碳培养箱中平放并旋松瓶盖四、死活细胞的鉴别：倒置显微镜下观察将细胞团吹散取一定量的细胞悬液到离心管中加入等体积台盼蓝染液混合并放置1min用血球计数板在显微镜下

7、进行死活细胞的计数计算每毫升原液细胞数以及细胞存活率3.实验设备及材料（一）仪器：超净工作台、干燥箱、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、显微镜、血球计数板（二）材料：微孔滤膜（直径25mm，孔径为0.22um）、细胞培养瓶、玻璃棒、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、各种规格的Tip、离心管、细胞培养瓶、滴管、人类淋巴细胞株（三）试剂：75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl、1%酚红、RPMI1640