人era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

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1、人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化作者：吴元明，陈苏民，陈南春，纪宗玲，刘惠萍，张俊杰【关键词】 人Era基因关戗键词:人Era基因;基因表达;蛋白纯化摘要:目菌的 在大肠杆菌中对人的e按ra基因进行表达、纯化.辶方法 PCR扩增hera宸基因，测序正确后克隆入大沥肠杆菌融合表达载体pRS衾ET-C，重组质粒pRS目ETC-hera以大肠杆菌BL21为宿主菌，用I裒PTG进行诱导表达.然后锕利用亲和层析的方法对表达胄蛋白进行纯化.结果 克隆了hera基因，测序正确硭;利用pRSET-C载体珧在大肠杆菌中融合表达了全澍长hera-cDNA基因恂，表达

2、量占细菌总蛋白的%舅.融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，在变性条预件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白，其纯板度达到了%.结论 利用基悚因重组技术在大肠杆菌中高赙表达了hera基因.并对欢融合蛋白进行了初步纯化.侑 Keywords:锷humanEragene;geneexpress戾ion;protEinp锹urifi-cation稹10/10 Abstract:绢AIMToexpress企humanEraprot雎EIninandpuri铝fyitAfterbei稔ngamplifiedb髂yPCRandident影ifiedbyseque彼

3、ncingthehumaつneragenewasi劾n-sertedinto疴expressionve金ctorpRSET-C.懔Therecombina├ntplasmidpRS恻ETC-herawastransformedin膂toBL21andind螓ucedwithexpressedproteinwaspurifiedb啖yaffinityThe衲humaneragene伪wasamplifiedＭandthesequen泡ceprovedtobe至hera-cDNAgen怃ehadbeenclon缵edintothevec勐torandex-pr

4、e瞿ssedin，andth骱eexpressedpr璨otein%ofthet丁otalbacteria沈lfusedproteiタnexistedinth尉epatternofin姹clusionbody，钤anditwaspuri饕fiedondenaturedcondition豆byusingNi-NT断AaffinitychromotographyTheherageneco厅uldbeexpress龄edwithhighef弓ficiencyinby牒usinggenerec百ombinationfu争sedproteinis喈purifiedp

5、rel船iminarily. 摸0引言 era基因蜍是1986年在测定大肠杆霹菌基因组序列时，在编码R裂NaseIII的rnc基兮因下游发现的一个开放读框嫁，因其编码的氨基酸序列与炊人及酵母的Ras蛋白有部首10/10分相似之处，命名为Ras纠-like基因［1］.e倭ra基因在原核生物中普遍谚存在，在真核生物如蠕虫、羧小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因疙.Era蛋白是小G蛋白家榧族的新成员.它由两个结构墼域组成:N端是一个典型的耆GTPase结构域;C端榫结构域为Era所特有，其偏中含有一个KH结构域［2耶］.在大肠杆菌中era基甲因和rnc基

6、因同属于rn噻c操纵元，rnc基因和e勿ra基因的表达共同受RN盔aseIII的负调控［3佞］.era是大肠杆菌中可庀以正常表达的基因，但表达水平极低.遗传学实验证实褙era基因与细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁〕殖所必需的重要基因［4］谵.高表达的细菌Era蛋白迢有GTP结合及GTPas％e活性［5］.最近发现细坂菌Era蛋白可以特异地与锎16S-rRNA结合［6《］.本室陈苏民教授通过檫计算机寻索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era嗤同源的EST序列，并且相盍继克隆了人及小鼠全长的e木ra-cDNA基因.人e杈ra-cDNA基因全长约蓖，含长度为

7、1038bp的诃开放读框，编码346氨基酸的蛋白质［7］.人ErБa与大肠杆菌Era蛋白全╂序列比较，有%相同、%相似.同样，hEra也是由胱N端的GTPase结构域嵯和C端KH结构域所构成［交8］.新近克隆的人及小鼠鹭era基因为整个era基冢因家族的功能研究提供了重逮要的资料.本研究目的是将绎hera基因在大肠杆菌中癖进行高表达、纯化.这为进砬一步研究hEra蛋白的功鼹能打下了良好的基础.10/10 1材料和方法 材料 瑟大肠杆菌BL21菌种购堡自Promega公司.p┇UC19质粒均为本教研室批保存;表达质粒pRSET习-C为Invitrogen公司

8、产品.pBS-he∮ra