资源描述：
《黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达量的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达量的影响第28卷第10期2009年10月水产FISHERIES科学SCIENCEVoI_28No.10OCt.2009黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达量的影响孙永欣,徐永平,汪婷婷,李亚洁,孟楠,米锐,李树英,都兴范(1.辽宁农业科学院大连生物技术研究所,辽宁大连116024;2.大连理工大学环境与生命学院,辽宁大连l16024)摘要:为研究黄芪多糖诱导仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达的影响,从体质量(10±1.22)g的仿刺参体腔细胞中克隆出长度为395bp的~-actin基因部分片段作为内参,利用半定量PCR法考察体内注射不同剂
2、量黄芪多糖(APS)后仿刺参体腔细胞中i型溶菌酶mRNA表达量变化.研究发现.5,10mg/kg剂量的APS可提高体细胞中溶菌酶mRNA表达量,其中5mg/kg剂量组达显着水平,剂量为20mg/kg时基本无效.关键词:黄芪多糖;仿刺参;溶菌酶;基因表达中图分类号:$968.9文献标识码:A文章编号:1003—1l11(2009)10—0572—03溶菌酶的主要作用是切断细菌细胞壁肽聚糖中N一乙酰葡萄糖胺和N一乙酰胞壁酸之间的B一1,4糖苷键,从而破坏细胞壁,引起细胞裂解.它广泛存在于各种动植物中,在生物免疫防御系统中发挥重要作用.海洋无脊椎动物血细胞是产生溶菌酶蛋白的主要场所【
3、1].在海参吞噬细胞中已发现溶酶体酶,它由溶菌酶,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶等组成,参与对外源性物质的降解[2].从仿刺参(Aposticho—pusjaponicus)体壁组织中已克隆出i型溶菌酶基因,推断其具有裂解细菌细胞壁和水解纤维蛋白的双重功能j.鉴于溶菌酶在仿刺参免疫系统中的重要作用,通过免疫增强剂提高溶菌酶活性是提高仿刺参免疫力的一个有效途径.黄芪(Astragalus)多糖(APS)能够提高动物的非特异性免疫力L5],有试验表明,APS作为饲料添加剂在试验的前40d显着提高溶菌酶活性(待发表).然而,有关APS调控仿刺参免疫力机理的报道很少,笔者研究了仿刺参体内注射A
4、PS对体腔细胞中溶菌酶mRNA表达量的影响,以进一步阐明APS提高仿刺参免疫力的机理.1材料与方法1.1试验材料体质量(10±1.22)g的仿刺参由大连太平洋海珍品养殖公司提供,于水槽(体积为300L)中充气暂养,每日换水1/3,于傍晚投喂商品饲料,水温l2～15℃.经过2周适应期进行试验.1.2黄芪多糖黄芪多糖来源于西安天园生物制剂厂,纯度为98,主要成分为葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖等.将APs溶于生理盐水中后过滤除菌(O.22m),配制成1mg/ml储备液.1.3操作方法仿刺参随机分成5组,即对照组,生理盐水组,APS1组,APS2组和APS3组,每组6只.将APS溶液用生理
5、盐水稀释后对仿刺参进行体腔注射.具体剂量:对照组0mg/kg,APS1组5mg/kg,APS2组10mg/kg,APS3组20mg/kg.生理盐水组中以生理盐水代替APS,剂量为5mg/kg.24h后,采用断尾法,用无菌Eppendor[离心管收集体腔液.将每组2只体腔液合并一管(约3m1),每组3管(n=3).为防止体内海水对体腔液的污染,收集体腔液前需将仿刺参于空气中暴露3～5min自行排水,在解剖时避免割破呼吸树.1.4体腔细胞的收集将收集到的体腔液于DEPC水处理后的离心管(1.5m1)中,4℃,3000r/rain离心5rain,弃上清液后,用0.5mlTrizol试
6、剂(Takara,大连宝生物公司)对体腔细胞进行充分吹打,直至细胞全部溶解.1.5总RNA提取和cDNA合成按照Trizol试剂盒使用说明提取细胞总RNA.将适量总RNA溶于少量DEPC处理水中,于260,280,320nm处测定吸光度,只有A26.:A28.比值大于1.8的RNA用于进一步试验.采用反转录试剂盒(Takara,大连宝生物公司)制备cDNA.收稿日期:2008—09—19;修回日期:2008—12—02.基金项目:国家"863"计划项目(2006AA10Z412).作者简介:孙永欣(1977一),男.助理研究员,研究方向:水产养殖;E—mail:sunyongx
7、in一2008@yahoo.com.crl第1o期孙永欣等:黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达量的影响5731.6B—actin基因和溶菌酶基因PCR反应PCR反应体系为2l.口一actin引物根据保守区自行设计,溶菌酶特异性引物根据已有序列设计,引物序列见表l.反应条件见表2.由于p—ac—tin在所有组织中均能保守表达,因此作为RT—PCR阳性对照.每个样本需要进行2次PCR以保证结果的可靠性.取PCR产物9txl进行琼脂糖凝胶(含Goldenview0.051/m1)电泳.并于可
