目的蛋白表达与纯化protocol

目的蛋白表达与纯化protocol

ID:13411433

大小:30.00 KB

页数:4页

时间:2018-07-22

目的蛋白表达与纯化protocol_第1页
目的蛋白表达与纯化protocol_第2页
目的蛋白表达与纯化protocol_第3页
目的蛋白表达与纯化protocol_第4页
资源描述:

《目的蛋白表达与纯化protocol》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试:1、挑一单克隆到3mlLB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养10h~12h。2、保种:700μl菌液+400μl80%灭菌甘油,充分混匀后置于-800C保存。3、扩大培养:以1:100接菌,即取50μl菌液到5mlLB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。4、对照取样:取1ml菌液,12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。对照5、另取1ml菌液于一新的试管中,加1/1000IPTG(终浓度为1mM),37

2、0C,220rpm振荡培养3h后收菌:12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。370C样品6、其余约3ml菌液于160C,220rpm继续振荡培养1h后,加0.5/1000IPTG(终浓度为0.5mM),160C,220rpm振荡培养12~24h(通常18h)后收菌:12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品,取20μl总蛋白,其余离心后分离上清和沉淀,进行SDS-PAGE电泳鉴定,上样顺序为:对照370C样品160C样品总蛋白上清沉

3、淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达,则可以进行大量表达与纯化,具体操作如下。大量表达:1、挑一单克隆到7.5mlLB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养10h~12h。注意:此步用50ml离心管摇菌!2、扩大培养:以1:100接菌,即取将上述7.5ml菌液全部接到750mlTB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。3、对照取样:取1ml菌液,12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。(对照)4、其余约菌液于160C,220rpm继续振荡

4、培养1h后,加0.5/1000IPTG(终浓度为0.5mM),160C,220rpm振荡培养12~24h(通常18h)后收菌:6000rpm、40C离心10min,弃尽上清,取一点沉淀做表达鉴定(160C样品),其余-200C保存。1、Bugbuster分别处理上述两个样品,进行SDS-PAGE电泳鉴定。(同小量表达中的7)菌体破碎(高压破菌法):1、若目的蛋白在上清中有表达,则可取剩余菌体Ng(根据目的蛋白的表达量而定),用4-6×Nml的lysisbuffer将菌体重悬,加入0.1mM的PMSF,置于50/100

5、ml小烧杯中,并将烧杯置于冰上。2、用超声破碎仪进行破碎,功率一般为100W~200W,超声时间为3s,间隙时间为5s,工作次数一般为99×4次。3、将破碎后的菌液移入50mlBECKMAN高速离心管中,18000rpm、40C离心30-40min,将上清移入一个新的50ml离心管中。Ni柱亲和层析:Lysisbuffer:50mMTris,300mMNaCl,pH8.0(可加入5-10%的甘油和1mMdTT,20mM咪唑)Washbuffer:50mMTris,300mMNaCl,20mM咪唑,pH8.0Eluti

6、onbuffer:50mMTris,300mMNaCl,500mM咪唑,pH8.01、取适量的beads灌入玻璃柱中,用大量的ddH2O冲洗beads,一般为10CV×5(CV代表柱体积,下同)。2、用lysisbuffer进行平衡:10CV×5。3、将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中,Mix1~2h。4、500g,40C离心2min,收集上清——flow-through。5、加入50mlwashbuffer,500g,40C离心2min,收集上清——wash1。6、加入50mlwashbuffer,5

7、00g,40C离心2min,收集上清——wash2。7、加入50mlwashbuffer,500g,40C离心2min,收集上清——wash3。8、将beads灌入玻璃柱中,继续用washbuffer洗10CV×3。9、用Elutionbuffer洗脱:0.5CV×10,用EP管分别收集eluates。10、SDS-PAGE电泳鉴定。Resinregeneration:1、用0.1MEDTA洗2CV(清洗至beads为无色)。2、ddH2O洗5CV。1、0.1MNaOH洗2CV。2、ddH2O洗5CV。3、加2CV的

8、NiCl2。4、ddH2O洗5CV。5、用20%乙醇洗2次beads,置于4~80C保存。GST柱亲和层析:Lysisbuffer:1×PBS(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)Washbuffer:1×PBSElutionbuffer:50mMTris,10mMreducedgl

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。