p73基因多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤关系的研究

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1、p73基因多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤关系的研究【摘要】　　目的探讨p73基因的多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤发生风险的关系。方法血液标本分为3组，包括结直肠腺癌组、结肠腺瘤组、结肠未见明显异常组，各60例。采用PCRRFLP方法检测血液标本p73基因多态性。组织标本分3组，分别取自结直肠腺癌病灶处、结肠腺瘤病灶处、结直肠腺癌患者的相应远离癌灶的正常黏膜组织，各30例，采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中p73蛋白表达情况。结果（1）p73基因多态性与结直肠腺癌、腺瘤的发生有相关性，且AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。（2）p73蛋白表达与结

2、直肠腺癌的发生、发展有相关性。结论p73基因多态性与结直肠癌的发生有相关性，且AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。p73蛋白表达的增加或上调与结直肠癌相关。【关键词】结直肠肿瘤；基因，肿瘤抑制；肿瘤抑制蛋白质类；多态现象，遗传10　　结直肠癌的发生是黏膜上皮受到遗传和环境等多种因素作用、导致多基因改变及相互作用的结果。已知p53基因是人类肿瘤中的重要抑癌基因，而p73基因作为p53家族的成员，在人类肿瘤中也起着重要作用。现已确定TAp73与p53类似，也能诱导不可逆的细胞周期停滞、促进细胞凋亡，并且此功能与TAp73激活p53靶基因如Bax、

3、p2lwaf1等的转录有关[1]。p73基因包含一个多态性，在上游起始子AUG外显子，理论上可能形成茎环结构，被认为可以改变基因表达从而影响p73结构。笔者通过研究p73蛋白在结肠腺癌组织、腺瘤组织及正常组织的表达水平，探讨其与结肠腺癌的细胞分化程度以及肿瘤发生发展的关系。　　1对象和方法　　1.1对象所有病例均来自福建省立医院内镜检查和外科手术治疗患者，其中结直肠癌主要指散发型，排除遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）。详细记录病人性别、年龄及结直肠肿瘤易感因素，如家族史、手术史、饮食等。血液标本分为3组，包括腺癌组60例，腺瘤组60例，

4、未见明显异常组60例。组织标本分为3组，分别取自结直肠腺癌病灶处30例，结肠腺瘤病灶处30例，结直肠腺癌患者的相应远离癌灶的正常黏膜组织30例。所有腺癌或腺瘤均经过内镜形态学及病理组织学证实。“结肠未见异常”为内镜形态学上结肠黏膜光滑的受检者。所有组织标本均为10%甲醛溶液固定、石蜡包埋。　　1.2方法　　1.2.1PCRRFLP取外周血2mL，用EDTA抗凝，基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa10D9081）进行基因组DNA提取，聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（PCRRFLP）。PCR引物（228bp)：　　上游：5’CAGG

5、AGGACAGAGCACGAG3’　　下游：5’CGAAGGTGGCTGAGGCTAG3’　　PCR循环参数：95℃变性5min，95℃30s→57℃45s→72℃30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物中加入1μL限制性内切酶Sty1，37℃孵育酶切7～8h，产物用2%琼脂糖胶电泳，结果用凝胶成像系统分析。　　1.2.2免疫组织化学染色采用二步法免疫组织化学染色。p73蛋白阳性物质定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒。阳性判定标准：在显微镜中倍视野（10×10）下观察阳性细胞分布情况，分别取4～5个独立的高倍视野（1

6、0×40），各计数200～250个细胞，阳性细胞<10%为阴性，阳性细胞>10%为阳性。比较结直肠腺癌和腺瘤以及远离病灶正常组织的细胞染色密度。　　1.3统计学处理SPSS12.0统计软件包进行统计学处理。采用χ2检验和Fisher确切概率法分析p73基因的多态性以及p73蛋白的表达在结直肠腺癌、腺瘤以及正常组中的差别，P<0.05为差别有统计学意义。10　　2结果　　2.1p73基因多态性当有AT时，酶切AT为156和72bp2个产物，GC型不能被Sty1酶切，仍为228bp产物（图1）。p73基因多态性在结直肠腺癌、腺瘤

7、组和正常组中的分布见表1。腺癌组和腺瘤组比较，χ2=1.703，P>0.0125，提示p73基因在腺癌组和腺瘤组基因型频率分布无显著差异；腺癌组和正常组比较，χ2=9.713，P<0.0125，提示p73基因在腺癌组和对照组基因型频率分布有统计学意义；腺瘤组和正常组比较，χ2=5.378，P>0.0125，提示p73基因在腺瘤组和正常组基因型频率分布无显著差异。并提示AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。　　图1PCR扩增产物经酶切后琼脂糖电脉结果（略）　　Fig1Restrictionanalysisofp73gene　　表

8、1p73多态性在腺癌、腺瘤和对照组中的分布（略）　　Tab1Thedistributionofthep73genotypesfrequencies　　表中数据为n(