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1、吡格列酮和罗格列酮对脂多糖诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响【摘要】目的：观察胰岛素增敏剂——噻唑烷二酮类(TZD)药物吡格列酮和罗格列酮对脂多糖（LPS）诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖的影响。方法：组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞；LPS（0.1，1，10mg·L-1）干预血管平滑肌细胞不同时间（0，12，24，48，72h）后，分别用吡格列酮和罗格列酮与10mg·L-1LPS共同孵育72h，四甲基偶氮咗盐微量酶比色（MTT）法检测血管平滑肌细胞增殖。结果：10mg·L-1LPS孵育72h导致血管平滑
2、肌细胞增殖程度最明显（P<0.01）;吡格列酮和罗格列酮可明显抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞增殖。结论：噻唑烷二酮类代表药吡格列酮和罗格列酮均对LPS诱导的血管平滑肌细胞异常增殖具有抑制作用，该类药物可能在治疗心血管疾病方面有较好的应用前景。【关键词】脂多糖；血管平滑肌细胞；增殖；吡格列酮；罗格列酮目前认为动脉粥样硬化（artherosclerosis;AS）是一种免疫调节的炎症性疾病,细菌性感染是临床上常见的致病原因,其中以内毒素血症最为多见,其主要毒性成分是脂多糖（LPS）［1］。血流中的LPS可损伤内皮细胞、血
3、小板,甚至经破损的血管壁直接作用于血管平滑肌细胞(vascularsmoothmuscle8cells,VSMCs),导致其增殖和迁移，引起一系列心血管反应。而VSMCs的增殖与迁移是动脉粥样硬化发生、发展的重要环节，可加速动脉粥样硬化的进程。胰岛素增敏剂--噻唑烷二酮类(TZD)药物,是目前临床上治疗2型糖尿病的一类新的药物,其代表药为罗格列酮(rosiglitazone，Rosi)和吡格列酮(pioglitazone,PIO)。近年研究发现此类药在心血管保护、炎症形成的抑制中起关键作用［2］。本研究通过观察吡格列酮和罗
4、格列酮对LPS诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖的影响,探讨Pio和Rosi在治疗动脉粥样硬化中的可能作用。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SD大鼠由潍坊医学院试验动物中心提供,体重100～150g。1.1.2试剂DMEM培养基（美国Gibico公司）;LPS（Sigma）;MTT(sangon);Pio(江苏恒瑞制药公司)；Rosi（革兰素史克）；胰蛋白酶（美国Gibico公司）；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；兔抗鼠α-actin抗体及sABC试剂盒均购自武汉博士德公司。1.2方法81.2.1大鼠胸主动
5、脉VSMCs的培养与鉴定用组织块贴壁法培养大鼠TASMCs。大鼠经戊巴比妥钠以45mg/kg麻醉后,无菌条件下迅速取出胸主动脉,仔细剥去外膜,沿纵向剪开血管，刮去内皮细胞,以无血清培养液洗2～3次,剪碎成1mm×1mm×1mm,均匀种植于瓶底壁,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液［3］,在5％CO2、37℃孵箱中培养，静止4d。观察后换液。细胞铺满瓶底80%以上时加入2.5g/L胰蛋白酶消化,1∶2分装传代，使用含10％胎牛血清的培养基培养。本实验培养的细胞相差显微镜观察:细胞外观呈长梭形，细胞生长致密时排列成束，并可重
6、叠生长，表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。采用免疫组化法对VSMC(α-actin)进行鉴定:激光共聚焦显微镜观察，证实为VSMCs。实验所用细胞为3～8代。1.2.2实验分组在进行干预前，无血清培养24h使细胞同步化，然后分组：①空白对照组：加入含有1%胎牛血清的DMEM培养液；②LPS0.1，1，10mg·L-1组作用不同时间（12，24，48，72h）；③10mg·L-1LPS与Pio（1，10，100umol·L-1）共同作用72h；④10mg·L-1LPS与Rosi(1，10，100umol·L-1）共同作用72
7、h。1.2.3MTT法测定细胞增殖用0.25%胰蛋白酶消化细胞并用含10%胎牛血清的DMEM培养液调制成5×104个/ml，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,每孔接种100μl,在37℃8,5%CO2条件下培养至细胞生长成次融合状态时,无血清培养24h后,加入各种干预因素继续培养,同时设调零组和正常对照组(未加任何刺激因素),每组设3个复孔,干预结束后每孔加入MTT(5g/l)20μl培养4h,弃去孔内液体,每孔加入DMSO150μl,震荡10min后,在自动酶标检测仪上读取波长为570nm的光吸收值(A)。实验结果以A
8、值表示,A值与活细胞的增殖呈正比,A值越大,表明细胞增殖越旺盛。每项试验重复3次。1.3统计学处理数据用x±s表示,用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析两组的均数比较采用S-N-K方法进行，以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1LPS对VSMCs增殖的影响0.1mg·L-1
