复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响

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1、复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响作者：江远，张玲，何金洋，郭兴伯【摘要】【目的】观察复方肝毒清对铁超载肝星状细胞(HSC)活化和凋亡的影响。【方法】体外培养HSCT6细胞，分为正常对照组、模型组、中药组(给药浓度为008g/L)。以柠檬酸铁胺(FAC)与HSCT6细胞共同温育，建立HSC铁超载模型。采用免疫组化法检测HSCT6细胞α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达，半定量聚合酶链反应(PCR)法检测细胞转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA的表达，TUNEL法检测HSCT6细胞的凋亡，电镜观察HSCT6

2、细胞超微结构。【结果】正常对照组和模型组HSCT6细胞αSMA大量表达，未见或仅见有较少细胞发生凋亡，而中药组HSC细胞αSMA表达明显减少，TGFβ1mRNA表达显著降低(P<005)，且出现明显细胞凋亡。【结论】中药复方肝毒清可能通过调节细胞铁的代谢，抑制HSC活化并诱导其发生凋亡，从而在体外发挥抗肝纤维化作用。【关键词】肝纤维化/中药疗法;复方肝毒清/药理学;肝星状细胞/病理学;肝星状细胞/超微结构;细胞培养铁超载与肝纤维化关系密切。研究表明，铁可通过诱导肝星状细胞(hepaticstellate13cells

3、，HSC)活化引起胶原沉积，从而导致肝纤维化的发生[1]。复方肝毒清具有抗乙肝病毒[2]、保护免疫性肝损伤[3]以及抗肝纤维化作用[4]。既然以扶正利湿解毒为治疗原则的复方肝毒清具有抗肝纤维化作用，那么复方肝毒清能否抑制铁诱导的HSC活化，并影响HSC的转归?本实验观察了复方肝毒清对铁超载HSC活化和凋亡的影响，旨在研究复方肝毒清对肝纤维化的体外逆转作用。现报道如下。　　1材料与方法　　11细胞系HSCT6细胞为SV40转染SD大鼠的肝星状细胞系，其表型为活化的肝星状细胞，由汪晓军博士惠赠。　　12中药复方复方肝毒清主要由白花

4、蛇舌草、三七、旱莲草、太子参、白芍等8味中药组成，药材均购于广州采芝林医药连锁店。购回后以蒸馏水500mL煎煮2次，每次30min，将2次药液合并后浓缩为1kg/L浓度，冷藏后尽快使用。　　13主要试剂与仪器柠檬酸铁胺[ammoniumiron(Ⅲ)citrate，FAC]，化学纯，购于国药集团化学试剂有限公司，批号：20060519，将FAC溶解于培养基中过滤，4℃保存，备用。噻唑蓝(MTT)由吉泰科技有限公司提供(批号：20050412)，鼠抗α平滑肌肌动蛋白(α13SMA，批号：BM0002)、山羊抗小鼠IgG(SA102

5、0)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(AR1022)、细胞凋亡检测试剂盒(MK1020)均由武汉博士德公司提供，转化生长因子β1(TGFβ1)引物、鼠类白血病病毒逆转录酶(MMLV逆转录酶)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、RNA酶抑制剂(RNaseinhibitor)均购自Fermentas公司，Mastermix荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于日本Toyobo公司，TrizolRNA抽取试剂购于MRC公司。7300型荧光定量PCR仪购于ABI公司。　　14细胞毒性实验(MTT比色法)细胞按1×108/L密度接种于96

6、孔培养板中，至细胞长满单层后，弃培养液。FAC设800、400、200、100、50、25、125、625μmol/L共8个浓度，复方肝毒清设10、2、04、008、0016、00032、000064、0000128g/L共8个浓度，每个浓度重复4孔，同时设立正常细胞作为对照组，继续培养24h后，加MTT溶液(5g/L)20μL/孔，37℃孵育3h。吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，震荡20min，全自动酶标仪测定各孔吸光度(D)值，测定波长为490nm。计算细胞生长抑制率：p抑制=(D对照组-D给

7、药组)/D对照组×100%。选择最大无细胞毒作用的FAC和中药浓度进行以下实验。　　2010年第27卷广州中医药大学学报江远，等.复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响第1期15建立HSC细胞铁超载模型HSCT6细胞培养于6孔板，每孔中均置入1138cm2之正方形盖玻片(无菌处理)。细胞分为正常对照组、铁超载模型组。待细胞贴壁长满后铁超载模型组中加入25μmol/LFAC(最大无细胞毒浓度)，正常对照组为正常培养的HSCT6细胞。细胞培养24h后弃上清，用40g/L多聚甲醛固定30min，予体积分数75%酒精洗5min

8、。蒸馏水漂洗晾干后行普鲁士蓝染色，显微镜下观察。　　16HSC细胞αSMA表达及细胞凋亡的检测　　161分组及处理HSCT6细胞培养于6孔板，每孔中均置入18cm2之正方形盖玻片(无菌处理)。细胞分为正常对照组、模型组、中