嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

《嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达【摘要】　　目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR)，从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET

2、-ip表达出49kDaTrx-IP的融合蛋白质，Westernblot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。【关键词】军团菌;ip基因;克隆;基因表达　　Abstract:ObjectiveToclonetheipgeneofLegionellapneumophila,toconstructrecombinantplasmidandtodetectitsexpressioninprokaryoticcell.MethodsTheipgen

3、ewasamplifiedfromthegenomicDNAofLegionellapneumophilawithPCR,andthenwasinsertedintotheprokaryoticexpressionvectorpET32a(+).TheprokaryoticexpressionrecombinantplasmidpETipwasconstructed.Afteridentificationwithrestrictionenzymeanalysis,PCRandnucleotidesequ

4、encing12analysis,theE.coliBL21containingtherecombinantplasmidpETipwasinducedwithIPTG.TheexpressionofipwassubsequentlydetectedbySDSpolyacrylaminegelelectrophoresisandWesternblotanalysis.ResultsTheipgeneof792bplongwasamplifiedandtherecombinantplasmidpETi

5、pwasconstructed.SDSPAGEanalysisshowedthattheTrxIPfusionproteinofapproximately49kDainsizewasexpressed.Theexpressedproteinscouldbeconfirmedbywesternblot.ConclusionTheprokaryoticexpressionrecombinantplasmidpETipwasconstructedsuccessfullyanditsexpressedeffi

6、cientlyinE.coli.　　Keywords：legionellapneumophila；ipgene；clone；geneexpression　　嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，通过空气传播，进入呼吸道的病原体在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖而发病。随着人们生活水平的提高，其危害性日益受到关注，目前尚无理想的防治措施，研制有效的军团菌疫苗是十分必要。嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生的29kDa外膜蛋白（29kDaimmunogenic12protein，IP）［1］，为嗜肺军团菌1～10

7、血清型所共有，具有种特异性，是机体免疫应答反应的主要免疫原。生物信息学分析显示其含有丰富的B细胞、T细胞表位，具有高度保守性，故选ip基因为构建DNA疫苗抗原候选基因。本研究通过PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因，将其定向克隆入原核克隆载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-ip，经鉴定后,并使ip基因在原核系统中得到表达，为进一步研究IP蛋白的结构、功能及其免疫原性和保护性功能等奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料嗜肺军团菌L1标准株及相应兔血清抗体由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。克隆宿主

8、大肠杆菌DH5a，质粒pET-32a(+)均由本室保存；限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ购自TOYOBO,NEBT4DNA连接酶购自基因生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)及浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1嗜肺军团菌ip基因的PCR扩增　　接种嗜肺军团菌L1于BCYE-a琼脂培养基，37℃烛缸法培养512d左右，收获细菌,提取其基因组DNA［