拟南芥hyprp蛋白azi在转基因烟草中的亚细胞定位及其对真菌病原体的抗性

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1、分类号：Q78学校代码：10697密级：公开学号：201020945硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对真菌病原体的抗性学科名称：细胞生物学作者：杜改亮指导老师:徐子勤教授西北大学学位评定委员会二○一三年西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采

2、用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它相关数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日----------------------------------------------------------西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，

3、也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：年月日拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对真菌病原体的抗性摘要拟南芥AZI1（At4g12470）基因编码的蛋白质属于HyPRP家族EARLI1亚家族，由N端的信号肽、中间的富含脯氨酸结构域（PRD）以及C端的8半胱氨酸结构域（8CM）构成。由于包含8CM结构域，AZI1也被认为是脂转移蛋白（LTP）家族的一个成员。已有的研究结果表明，与许多L

4、TP蛋白一样，AZI1在拟南芥应答病原体侵染过程中具有重要作用。本工作通过农杆菌遗传转化技术将AZI1基因导入烟草基因组，利用转基因烟草植株研究了它的亚细胞定位特征以及它对灰霉菌等植物病原体的抗性功能。本工作在利用PCR技术克隆AZI1基因时，首先通过DNAStar软件中的MapDraw程序对编码序列进行了限制性作图分析，在设计的上下游引物5′-端分别引入了编码序列内部不存在的NcoI和SpeI酶切位点，然后以Col-0基因组DNA为模板、采用高保真耐热DNA聚合酶Pfu扩增得到AZI1基因的开放阅读框序列。进一步采用Nco

5、I和SpeI对扩增产物和pCAMBIA1302载体进行双酶切，通过T4DNA连接酶构建产生AZI1-GFP融合表达载体。经过测序验证后，将重组质粒导入农杆菌LBA4404受体细胞，接着用菌落PCR鉴定后的农杆菌细胞转化烟草的叶片外植体，在潮霉素抗性培养基上再生得到转基因烟草植株。PCR、RT-PCR以及Southern印迹实验结果显示，AZI1基因已经整合到烟草基因组DNA中，而且能够有效表达。激光共聚焦显微观察发现，AZI1蛋白定位在细胞表面，这与其具有信号肽的结构特征一致。用灰霉菌孢子在离体条件下侵染转基因烟草和野生型烟

6、草叶片，结果证明AZI1转基因烟草对真菌病原体具有一定的抗性。DAB和台盼蓝染色结果也说明AZI1基因具有抵抗生物胁迫的功能。为了证实AZI1蛋白的抗真菌活性，本工作同时构建了原核表达载体，利用大肠杆菌细胞制备了不具有信号肽的AZI1重组蛋白。首先以拟南芥Col-0生态型基因组DNA为模板扩增得到AZI1基因的PRD-8CM编码序列，经XhoI和EcoRI酶切后用T4DNA连接酶构建产生pET28a-AZI1原核表达载体；进一步将测序正确的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)受体细胞，用IPTG对AZI1重组蛋白进行了诱导

7、表达。ixWestern免疫印迹实验结果显示，AZI1重组蛋白主要以包涵体的形式存在。体外抑菌实验以及激光共聚焦显微观察结果表明，采用镍离子亲和层析柱纯化的AZI1重组蛋白对灰霉菌和酿酒酵母细胞均具有抑制作用。关键词AZI1-GFP融合表达载体，AZI1原核表达载体，亚细胞定位，AZI1蛋白表达与纯化，抗性分析，抑菌实验ixSubcellularlocalizationofArabidopsisHyPRPproteinAZI1anditsresistancetofungalpathogenintransgenictobacc

8、oplantsAbstractTheproteinencodedbyArabidopsisAZI1(At4g12470)belongstoHyPRPfamilyandEARLI1subfamily,itisconstitutedbyaN-terminalsignalpeptide,apro