猪肺炎支原体生长培养基的筛选

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1、猪肺炎支原体生长培养基的筛选李石1项目来源：新疆兵团农业科技重大攻关计划课题(2010GG04)2作者简介：李石（1988-），男，汉族，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向：动物传染病的诊断与防治Tel:15886938041,E-mail：ls451281773@163.com3通讯作者：李劼（1965-），女，汉族，副教授，硕士，研究方向：动物传染病的诊断与防治周霞（1968-），女，教授，博士，研究方向：动物传染病的诊断与防治，李劼*，周霞*(新疆石河子大学动物科技学院，石河子市　832003)摘要：为了解猪肺炎支原体的培养特性，筛选出肺炎支原体生长的最适培养基，本实验采用颜色改变单位（C

2、CU)法和PCR方法对猪肺炎支原体在四种常用培养基及改良KM2培养基中生长情况进行了检测与比较。结果显示：本实验室改良KM2培养基为最适培养基，10天时颜色改变单位可达108CCU/mL。关键词：猪肺炎支原体；培养基；筛选ThescreeningofMycoplasmahyopneumoniaegrowthmediumLiShi,LiJie*,ZhouXia*(Collegeofanimalscienceandtechnologyofshiheziuniversity,Shihezi832003,China)Abstract:Inordertodeveloptheculturecharacte

3、risticsofMycoplasmahyopneumoniae,pickoutthemostsuitablemedium,thecolorchangeunit(CCU)methodandPCRmethodwasusedtotestandcomparethecultureofswinemycoplasmalpneumoniacellnumberbetweenfourkindsofmediumandimprovedKM2medium.Theresultsshowedthat:theimprovedKM2mediumwastheoptimummedium,thecolorchangeunitis1

4、08CCU/mlafter10daysofculture.Keywords:Mycoplasmahyopneymoniae;medium;screening猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneymoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS，又称“喘气病”）的主要病原。猪肺炎支原体是一种微小的原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成呈点状露珠样菌落。但是由于生长速度慢，培养条件苛刻而难以培养[1],常因猪鼻支原体的过度生长而被掩盖[2]。猪肺炎支原体的培养被认为是该病原体检测的黄金标准[3]。本实验将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清

5、培养基、A26培养基、KM2培养基以及改良KM2培养基中进行了培养试验，采用颜色改变单位（CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，为快速、有效地诊断猪支原体肺炎提供参考依据。1材料及方法1.1材料1.1.1实验菌株猪肺炎支原体168株，从南京天邦生物科技有限公司生产的猪支原体肺炎克隆弱毒活疫苗(支必宁)中分离。猪肺炎支原体强毒济南株，由新疆畜牧科学院兽医研究所惠赠。1.1.2培养基Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)、A26肉汤培养基(简称A26培养基)和驴血清培养基参考文献[4]配制；KM2培养基购于江苏

6、农科院兽医所；改良KM2培养基由本实验室自己配制(1L：10g/L水解乳蛋白Hank's液400mL；DMEM400mL；无菌猪血清200mL；酵母浸液10mL；青霉素200IU/mL；酚红4g/L；pH调至7.6）。1.1.3试剂及仪器10×Buffer、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs、2.5UTaq酶(北京诺维森生物科技有限公司)；Marker1、LodingBuffer(广东东盛生物科技有限公司)；PCR仪（TC-512)，电泳仪等。1.2方法1.2.1菌株分离与复苏将冻存的支必宁和强毒济南株，在无菌条件下，分别用3mL灭菌水稀释，按10%的比例分别接入到5种液

7、体培养基中进行菌株分离与复苏培养，每7天传代1次，共传2～3代。1.2.2颜色改变单位(CCU)计数将5种液体培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7mL，于第一管加入菌液0.3mL，混匀后吸取0.3mL至第二管，依次类推做10倍梯度稀释直到10-8，从最后一管中吸取0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照，每种培养基做两个平行组。于37℃恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，以培养基颜色改变的最