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1、一株产纤维素酶细菌的筛选及初步鉴定学生：田继霞指导老师：张慧瑛（单位：农业与生物技术学院工程09（1）班734000）摘要:筛选1株产纤维素酶的细菌。通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化得到16株纤维素分解菌,经刚果红染色鉴定和液体发酵培养后对其进行了菌种初步鉴定及产酶条件的初步优化。获得1株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3。LT3为革兰氏阳性菌,菌体成杆状,经发酵优化培养后,较适产酶条件为甘蔗渣20gPL,pH7.0、30℃培养120h,CMC酶活为71.17UPmL,滤纸酶活为33.37UPmL。通过克隆其16SrDNA序列
2、,对其进行系统进化分析,鉴定为蜡状芽孢杆菌。关键词:碱性纤维素酶;16SrDNA;细菌引言：纤维素材料是自然界中最丰富的可再生资源。利用现代生物技术将纤维素材料转化为乙醇等液体燃料,不仅可以作为新资源新能源为人类造福,缓解或解决化石能源对环境污染的问题,同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用,现已受到世界各国的普遍重视。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高
3、活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。目前研究较多的是霉菌,其中木霉、曲霉、根霉和青霉均具有较强的酶活力,尤以绿色木霉、里氏木霉和康氏木霉为典型;而对细菌的研究很少有报道。由细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性。近20年来,随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。本研究从木材厂附近的腐烂朽木土壤的特殊生境中筛选到一株产碱性纤维素酶的菌株LT3,并对其产酶条件进行了初步优化,对研究纤维素酶作用机理及纤维素酶制剂的生产具有潜在理论和应用价值。
4、1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂:PCRmix(购自某公司),胶回收试剂盒(购自某公司),羧甲基纤维素钠、硝基水杨酸试剂(酒石酸钾钠、DNS、NaOH、苯酚、无水亚硫酸钠)、pH4.6醋酸缓冲液(冰醋酸、醋酸钠)、刚果红、无水葡萄糖,试剂均为分析纯试剂,购自某公司。1.1.2 培养基富集培养基(L-1):CMC-Na10g,黄豆饼粉5g,(NH4)2SO42.5g,pH8.5。初筛培养基(L-1):CMC-Na10g,黄豆饼粉5g,(NH4)2SO42.5g,pH8.5,琼脂1.5%。斜面保藏培养基(L-1):麸皮70g,黄豆饼粉30g,
5、(NH4)2SO42.5g,pH6.0,琼脂条2%。液体发酵培养基(L-1):CMC-Na10g,麸皮10g,(NH4)2SO43g,MgSO40.4g,酵母膏015g,CaCl20.4g,KH2PO41g,蛋白胨2g,pH8.5。碳源优化培养基:(200mL):1#:CMC-Na1g,麸皮3g,(NH4)2SO40.6g,MgSO40.08g,酵母膏0.1g,CaCl20.08g,KH2PO40.2g,蛋白胨0.4g。2#:甘蔗渣4g,(NH4)2SO4016g,MgSO40.08g,酵母膏011g,CaCl20.08gKH2PO40.2g,蛋白胨0
6、.4g。3#:CMC-Na2g,甘蔗渣2g,(NH4)2SO40.6g,MgSO40.08g,酵母膏0.1g,CaCl20.08g,KH2PO40.2g,蛋白胨0.4g。LB培养基:(L-1):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,pH7.0。酶活鉴定板(L-1):CMC-Na10g,琼脂粉1.5%,pH自然。1.2 方法1.2.1 样品采集来自某木屑厂,采集腐烂的朽木屑及其附近土壤。共9样,用于分离选育纤维素降解菌。1.2.2 富集初筛取1g样品粉末置于无菌三角瓶(含30mL富集培养基)中,25℃和220rPmin下,摇床培养48h。取富集后的培
7、养液按10-2、10-3、10-4、10-6、10-8配制不同梯度稀释液,分别涂布于初筛平板中,倒置恒温培养箱28℃、培养65h。往平板中加入1mgPmL刚果红溶液,染色1h,弃去染液后,加入适量1molPL的NaCl溶液,洗涤1h。分离能够旺盛生长,并在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株,接种于斜面培养基中25℃培养48h,然后4℃低温保存。1.2.3 发酵复筛将初筛得到的产纤维素酶菌株以1接种环P30mL培养基的接种量接种到液体产酶培养基中,于30℃、180rPmin下振荡培养5d后,测定初酶液的CMC酶活和滤纸酶活
8、,最终以酶活值作为筛选纤维素酶高产菌的标准,筛选CMC酶活和滤纸酶活高的菌株。采用3,5-二硝
