抗烟草青枯病菌的芽胞杆菌筛选和鉴定

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1、第40卷第1期植物保护学报Vo1．40No．12013年2月ACTAPHYTOPHYLACICASINICAFeb．2013抗烟草青枯病菌的芽胞杆菌筛选和鉴定Screening，identificationofantagonisticrhizosphericBacillussp．LW-6againsttobaccobacterialwilt刘伟沈小英段军娜牛小义宋双安德荣(西北农林科技大学植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100)LiuWeiShenXiaoyingDuanJunnaNiuXiaoyiSongS

2、huangAnDerong(StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas，CollegeofPlantProtection，NorthwestA＆FUniversity，Yangling712100，ShannxiProvince，China)烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌RalatoniaSO—化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆lanacearum引起的一种土传病害¨J。此病是热带、状、产芽孢、革兰氏染色阳性的分离物为芽胞杆亚热带地区烟草的主要病害之一，在我国长江流域菌。拮抗芽

3、胞杆菌的筛选：用TTC培养基选择具及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、湖南、四有活性的烟草青枯病菌作为指示菌，将烟草青枯病川及贵州烟区危害较重。菌配成2×10CFU／mL浓度的菌悬液，转接到BPA烟草青枯病自发现以来，引起了国内外学者的培养基上，制成青枯病菌含菌培养基。在平板中央广泛关注。目前，在生产中主要采用化学农药防治，接上述己分离纯化的芽胞杆菌菌株，30℃培养2～3但是仍无法有效防止该病发生，而且容易产生抗药天，测定抑菌圈直径和抑菌带的大小。性和造成环境污染。生物防治具有无污染、无公害1．3拮抗芽胞杆菌的鉴定：菌体形态、培养特征

4、观和长效性等优点，在植物病害的防治中占据越来越察及生理生化指标测定参照柳凤等方法。16S重要的位置。李清飞等从福建烟田根际土壤中rDNA基因序列测定及其系统进化树的构建参照分离出5株对烟草青枯病有明显抑制作用的细菌。Todorov等。提取细菌基因组DNA为模板，以7fLemessa&Zellerl4从埃塞俄比亚烟田根际土壤中筛(5．CAGAGrGATCCTGGCT一3)和1540r(5一AG—选出6株对烟草青枯病有明显拮抗作用的细菌。本GAGGTGATCCAGCCGCA．3)为上、下游引物扩增菌研究对烟草种植区根际土壤进行拮抗细菌的分离筛

5、株的16SrDNA。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳选和鉴定，以期为防治烟草青枯病提供生防资源。检测后送往上海生工生物工程有限公司进行序列测1材料与方法定，测序结果用BLAST软件在GenBank进行同源性1．1材料：土样：从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中比较。以ClustalX进行多序列比对后，用MEGA等地的健康烟草土壤中采集土样30份。培养基：5．0的Neighbor—Joining法构建系统发育树，并进行TYC培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，LB液体培养基，1000次Bootstraps检测。BPA固体培养基，NA固体培养基，NA拮抗菌突

6、变2结果与分析株回收培养基：对应NA培养基中加入0．O1％氯化2．1拮抗细茵的筛选结果三苯基四氮唑。供试菌株：烟草青枯病菌R．SO—从采集的30份土壤样品中，分离得到780株芽lanacearum由西北农林科技大学植物病害综合治理胞杆菌。通过对所分离的芽胞杆菌进行拮抗初筛，实验室提供。得到抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-6，抑菌圈1．2拮抗芽胞杆菌的分离：称取烟草根际土壤10g，直径为21．05mlTl，抑菌带宽为8．37mm。倒入装有90mL灭菌水的锥形瓶中，160r／min振荡2．2LW一6菌株鉴定20min，80水浴30min，1

7、0倍稀释，涂布分离。纯培养性状、形态学特征及生理生化特征：在NA基金项目：高等学校学科创新引智计划(No．B07049)，国家“863”计划(2007AA021503)作者简介：刘伟，女，1987年生，硕士研究生，研究方向为微生物资源利用，E-mail：weiweipeng．3800006@163．corn通讯作者(Authorforcorrespondence)，E—mail：anderong323@163．con；收稿日期：2012—09—1096植物保护学报40卷固体培养基上LW-6菌落呈现奶白色，菌落表面粗糖、木糖、甘露糖、接触酶

8、、脂肪酶、脲酶及氧化酶均糙，边缘呈现锯齿状，透射电镜显示Lw一6呈杆状，呈阳性；V．P试验为阳性；不利用柠檬酸盐。生长革兰氏阳性，周生鞭毛，单个细胞大小为0．5～0．6温度为10～60℃，最适