吩噻嗪类药物单链抗体的制备及进化

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1、硕士学位（毕业）论文吩噻嗪类药物单链抗体的制备及进化学位申请人：史芳舒指导教师：王建平教授合作教师：刘静副教授学科专业：基础兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年五月三十一日分类号：S859.84单位代码：10086密级：公开学号：20152200396吩噻嗪类药物单链抗体的制备及进化PreparationanddirectionalevolutionoftheAnti-phenothiazinesSingleChainAntibodyFragment学位申请人：史芳舒指导教师：王建平教授合作教师：刘

2、静副教授学科专业：基础兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年五月三十一日本研究由国家自然科学基金项目“兽药重组ScFv抗体的分子识别机制及双特异性ScFv抗体研究（31271869）”、河北省自然科学基金项目“兽药单链抗体微观构象匹配机制及定向进化（C2015204049）”、河北省研究生创新项目“兽药ScFv抗体的制备及定向进化（CXZZSS2017066）”资助摘要吩噻嗪类药物在养殖业中的非法使用会造成此类药物在动物源性食品中的残留，从而危害人类健康。在众多残留分析方法中，酶免疫分析法是最常用的快

3、速筛选法。要建立针对吩噻嗪类药物的多残留酶免疫分析法，制备一种广谱识别性抗体至关重要。本研究以2-氯吩噻嗪为半抗原，制备了一株广谱单克隆抗体。间接竞争ELISA法检测表明，该单克隆抗体可以同时识别氯丙嗪、异丙嗪、乙酰丙嗪、奋乃静和氟奋乃静等5种吩噻嗪类药物，IC50为1.22~500ng/mL，交叉反应率为0.4~98%。然后，从杂交瘤细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，扩增出抗体的重链可变区和轻链可变区基因，拼接成单链抗体基因（ScFv），将其插入到BL21(DE3)菌中表达出ScFv抗体。间接竞争ELISA法检测表明，该S

4、cFv抗体对5种药物的IC50为1.31~56ng/mL，交叉反应率为2.3~99.2%，与母源单克隆抗体相当。利用YASARA软件将该ScFv抗体与5种药物分别进行对接，结果显示，抗体结合腔主要由重链CDR3和轻链CDR1、CDR2、CDR3区组成，关键接触氨基酸为Arg101、Tyr102、Tyr162、Phe164、Tyr179、Leu180、Trp221，疏水作用力是主要的分子间作用力。然后，利用定点突变技术将轻链CDR2的Phe164突变为Pro164，制备出一种ScFv突变体。间接竞争ELISA法检测表明，该突变体对

5、5种药物亲和力得到较大的提升，IC50为0.4~5.1ng/mL。利用该抗体建立的ELISA法可以检测肉组织中的这5种吩噻嗪类药物，检测限为0.1~1.8ng/g，添加回收率为66.4~97.2%。本试验基于基因工程和计算模拟的方法，探究了单链抗体的分子识别机制，并对其定向进化，为研究其他小分子物质的分子识别机制及体外进化奠定了基础，对保障动物源性食品安全具有重要意义。关键词：吩噻嗪类药物；单克隆抗体；单链抗体；分子对接；定点突变；ELISAPreparationanddirectionalevolutionoftheAnti-

6、phenothiazinesSingleChainAntibodyFragmentCandidate:ShiFangshuMajor:BasicVeterinaryMedicineAdvisors:WangJianpingAbstractPhenothiazinesareusedextensivelyinanimals,andtheirresiduesinanimalderivedfoodaredangerstotheconsumers.Amongtheanalyticalmethods,enzymelinkedimmunoso

7、rbentassayisthecommonlyusedscreeningmethod.Therefore,itisveryimportanttoproduceabroadspecificantibodyforphenothiazines.Inthisstudy,2-chlorophenothiazinewasusedasthehaptentoproduceamonoclonalantibody.TheindirectELISAmethodshowedthatthemonoclonalantibodycouldsimultaneo

8、uslyrecognizefivephenothiazinedrugs,includingchlorpromazine,promethazine,acepromazine,perphenazineandtriflupromazine.TheIC50valuesw