牛肠道病毒BJ101株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救

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1、硕士学位（毕业）论文牛肠道病毒BJ101株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救学位申请人：张姗指导教师：孙继国教授侯绍华副研究员学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200400牛肠道病毒BJ101株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救ConstructionandRescueofBovineEnterovirusStrainBJ101InfectiousClone学位申请人：张姗指导教师：孙继国教授侯绍华副研究员学科专业：预

2、防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日摘要牛肠道病毒（BovineEnterovirus,BEV）为微RNA病毒科肠道病毒属成员。基因组是不分节段的大小约为7500bp的单股正链RNA。BEV宿主范围广泛，能感染牛、羊，负鼠和海豚等，一般表现为亚临床症状，有时引起腹泻和呼吸道疾病。牛肠道病毒包括牛肠道病毒E型（BovineEnterovirusE，BEV-E）和牛肠道病毒F型（BovineEnterovirusF，BEV-F），BEV-E分为四个亚型，BEV-E1到BEV-E4；BEV-F分为六个亚

3、型，BEV-F1到BEV-F6。牛肠道病毒毒力较弱、能够耐受酸性环境，是很好的候选疫苗载体。本研究分离得到一株BEVBJ101毒株，对其全基因组进行测序，并以此为基础构建BJ101株的全长感染性cDNA克隆，病毒拯救成功，并分析了拯救病毒的生物学特性，旨在为研究BEV致病机制、研发新型基因工程疫苗提供科学依据。采用RT-PCR方法从北京某牛场有腹泻症状牛的粪便样品中分离到一株牛肠道病毒，命名为BJ101，分离的病毒在MDBK细胞上的TCID-6.450为１×10/0.1mＬ,经电镜观察发现其病毒颗粒符合微RNA病毒粒子特征，直径为25n

4、m～30nm，无囊膜，BJ101株的基因组长度为7409bp，其中5'非编码区(UTR)长812bp，3'UTR长72bp，病毒基因组开放阅读框(ORF)全长6525bp，编码区内没有核苷酸数目的变化。对核苷酸序列进行比对分析发现，在5’UTR区，与PS42株、PS83株核苷酸序列相似性最高为84.9％和85.0％，在3’UTR区，与K2577株和SL305株的核苷酸序列相似性最高，均为91.5％。BJ101的VP1、VP2、VP3、和P1与E2型的毒株核苷酸和氨基酸序列的相似性都最高，进化树上处于同一分支，但VP4处与E1属的核苷酸和

5、氨基酸序列的相似性都最高，进化树上处于同一分支。由于BEV的分型主要依据是VP1的核苷酸和氨基酸序列，所以BJ101株属于E2型，并且在VP4处可能存在与E1型毒株的重组。根据BJ101全长核苷酸序列，去掉pBlueScriptSK（-）载体的T7启动子并在多克隆位点仅保留SalⅠ和EcoRⅠ两个限制性内切酶位点。将BEV全基因序列分为A、B、C三个片段进行扩增，在A片段的5’端用引物引入T7启动子序列，在B和C两片段重叠部分通过引物引入分子标记EcoRⅤ酶切位点（氨基酸同义突变）。将阳性的GpBSK-BEV质粒线性化，转染BSR-T7

6、细胞系拯救病毒，将获得的病毒在MDBK细胞上接毒，通过细胞病变、遗标记检测、基因组测序、间接免疫荧光等验证显示获得了rBEV。rBEV与亲本毒有相似的TCID50及生长曲线。综上所述，本研究获得了BJ101株的感染性cDNA克隆并能拯救出病毒，为进一步研究BEV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供了技术平台。关键词：牛肠道病毒；分离；基因组；感染性cDNA克隆ConstructionandRescueofBovineEnterovirusStrainBJ101InfectiousCloneAuthor:ZhangShanAdvisors

7、:Prof.SunJiguo;A/Prof.HouShaohuaMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAbstractBovineenteroviruses(BEV)isamemberoftheenterovirusgenusofPicornaviridaefamily.Itcontainsasingle-stranded,positive-senseandpolyadenylatedviralRNAgenomeofapproximately7500bp.Ithasawiderangeofhostssuch

8、ascattle,sheep,possumsanddolphins.AlargerangeofnaturalhostscanbeinfectedbyBEV,suchascattle,sheep,possum