趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用

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1、硕士学位（毕业）论文趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用学位申请人：孙立旦指导教师：宋勤叶教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200399趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用EffectsofChemokinesinPorcineEpidemicDiarrheaVirusInfection学位申请人：孙立旦指导教师：宋勤叶教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日摘要猪流行性腹泻(Porcineepidemicd

2、iarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起猪的一种急性、接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水、急性肠炎为特征。近年来PEDV导致大批仔猪死亡，给养猪业造成了巨大经济损失，但目前对其感染免疫机制的了解尚不深入。趋化因子是募集白细胞至感染部位的一类低分子量蛋白质，其趋化作用是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体天然免疫功能的一个重要方面。本研究围绕PEDV感染免疫选题，通过体内外试验，探索趋化因子在PEDV感染中的作用，旨在为深入阐明PEDV的感染免疫机制提供科学依据。将6头21日龄健康仔猪随机分为PEDV强毒株

3、感染组和阴性对照组。感染组每6.6TCID头口服接种1.5×1050的PEDV；对照组接种等体积的细胞维持液。感染后3d应用基因表达谱芯片技术和FQ-PCR检测回肠组织中趋化因子mRNA的表达量。结果表明，感染猪回肠组织中趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。为了验证PEDV强毒株感染宿主细胞后趋化因子表达水平的变化，将IPEC-J2细胞分为HBQY2016强毒株感染组、CV777弱毒株感染组、LPS阳性对照组和阴性对照组。两个病毒感染组分别接种0.5MOI的HBQY2016强毒株和CV777弱毒株

4、，阳性对照组用10μg/mL的LPS刺激，阴性对照组加入等体积的维持液。感染后18~20h收集细胞，两个病毒感染组的MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9和CXCL13mRNA的表达水平显著上升（P<0.05），细胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平显著升高（P<0.05）。为了进一步阐明趋化因子在PEDV感染中的作用，设计合成并筛选了分别对MCP-1、CXCL9、CXCL13具有较高抑制活性的siRNA，并将IPEC-J2细胞分为PEDV感染组（强/弱毒株）、siRNA干扰-（强/弱毒株）感染组、siRNA阴性（NC）-PED

5、V（强/弱毒株）感染对照组和阴性对照组。通过Transwell趋化试验和流式细胞术分析，与病毒感染组相比，MCP-1干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组细胞下室内CD14+单核细胞的个数分别下降400个细胞（P<0.05）和1152个细胞（P<0.05）；CXCL9干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群分别平均下降677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞（P<0.05）；CXCL13干扰-H

6、BQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD19+B细胞亚群分别平均下降279个细胞和164个细胞（P<0.05）。上述实验证明，PEDV强毒株感染引起趋化因子（MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13）表达量显著上调。强/弱毒株诱导产生的MCP-1对CD14+单核细胞，CXCL9对CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群，CXCL13对CD19+B细胞具有趋化作用。关键词：猪流行性腹泻病毒；仔猪；趋化因子；IPEC-J2细胞EffectsofChemokin

7、esinPorcineEpidemicDiarrheaVirusInfectionAuthor:SunLi-danAdvisor:ProfessorSongQin-yeMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED),causedbyporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),isanacuteandhighlycontagio