高效液相色谱法课件_1 (2)

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1、第十章高效液相色谱法第一节固定相和流动相第二节高效液相色谱仪第三节液-固色谱法第四节化学键合相色谱法第五节离子交换色谱法第六节尺寸排阻色谱法第七节分离方式的选择及应用highperformanceliquidchromatograph,HPLC2021/7/10色谱法分类示意图2021/7/10概述高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相

2、柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。2021/7/10一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效

3、低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测2021/7/10二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物

4、的80%2021/7/102．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）2021/7/10第一节固定相和流动相一、固定相二、流动相2021/7/10一、固定相1.高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两

5、大类。（1）刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108～1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。（2）硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。2021/7/102.固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。（1）表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积

6、小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。2021/7/10（2）全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10m），孔较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。2021/7/10表10-1两类固定相的性能比较2021/7/10二、流动相对流动相的要求是：1.纯度高由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。2.粘度低若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不

7、利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。2021/7/103.化学稳定性好不能选与样品发生反应或聚合的溶剂4.溶剂沸点要高于55℃低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡5.溶剂要能完全浸润固定相溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏2021/7/106.溶剂与检测器匹配对于紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。对于折光率检测器，要求选择与组

8、分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达