羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究

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1、羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究【摘要】　　目的探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸标记大鼠骨髓间质干细胞的可行性和最适条件。方法清洁型SD大鼠20只，用密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化、培养大鼠MSCs，取长满2cm×2cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs，用，5，10，20，40μmol/L的CFSE分别作用1，5，10，15，20min后染色，通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。采用MTT法检测最佳条件CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力。结果浓度10μmol/L

2、的CFSE在3℃下孵育10min为MSCs染色、观察和研究的最佳条件。此条件下，CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。结论活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法，浓度10μmol/L的CFSE在3℃下孵育10min为CFSE标记大鼠MSCs的最佳条件。【关键词】荧光素；乙酰乙酸盐类；骨髓细胞；间质干细胞；染色与标记；大鼠骨髓间质干细胞是骨髓内的非造血干细胞，具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点，是组织工程和细胞移

3、植治疗的最佳种子细胞[12]。为研究MSCs的移植疗效，需对MSCs在体内的存活、迁移、分布及增殖、分化进行监测，因此需要有效的标记方法区别供体细胞和受体细胞。已有的标记物如放射性探针、荧光素探针和绿色荧光蛋白等用于MSCs标记，但在应用过程中也存在诸多问题。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸是一种可穿过细胞膜、自动而且不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合的荧光染料，近年来在神经科学和免疫学已有广泛应用[3]。但CFSE对不同细胞体外染色的标记时间和标记浓度不同[4]。为探讨CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度，笔者应用CFSE对体外

4、培养的大鼠MSCs染色进行系统研究，报告如下。　1材料与方法材料实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠20只，2～3月龄，体质量150～250g[福建医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(闽XX－0008)]。主要试剂和仪器DMEM培养基、胎牛血清FBS；胰蛋白酶；PBS、FicollPaque分离液；染料CFSE；荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD34PE、CD45FITC、CD29FITC、CD90FITC(美国PharMingen公司)；ThermoFormaCO2孵育箱，BeckmancounterEpicsXL流式细胞

5、仪，倒置相差显微镜，倒置相差荧光显微镜，激光共聚焦显微镜(德国LEIca公司)。方法MSCs的培养、传代与鉴定大鼠氯胺酮腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10mL培养液冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含FicollPaque分离液mL的试管内梯度离心，吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为3℃、饱和湿度、体积分数为的CO2，培养液为DMEM。每3～d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞，传代并检测CD34、CD45、CD29、CD90。CFSE染色

6、及最佳条件筛选.mgCFSE用500μL二甲基亚枫溶解，制成10mmol/L的储存液，放于－20℃冰箱内保存。临用前取适量，用MSCs培养基分别稀释成，5，10，20，40μmol/L的不同浓度。取长满2cm×2cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs6瓶，其中1瓶做等量空白对照，其余25瓶分5组，每组5瓶，分别加入含不同浓度CFSE的MSCs培养基mL，置3℃培养箱分别孵育1，5，10，15，20min。用PBS漂洗3次，490nm激发波长荧光显微镜下观察CFSE标记情况。标记率为：　　标记率＝暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见的细胞数

7、×100％30nm发射波长激光共聚焦显微镜下测定细胞荧光强度。随后用%胰酶1mL消化，离心管离心。弃去上清，用含10%FBS培养基mL吹打成单细胞悬液。每瓶取1mL悬液进行台盼蓝染色，观察MSCs的存活率：　　存活率＝光镜下活细胞数/总细胞数×100％其余悬液按1∶2的比例接种于2cm×2cm培养瓶中，2h后观察记录MSCs的贴壁率：　　贴壁率＝(倒置相差显微镜下接种细胞数－未贴壁的细胞数)/接种细胞数×100％上述步骤重复4次，通过统计学分析筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。标记细胞增殖能力检测取第3代MSCs接种

8、于96孔板中，每孔体积100μL，细胞数为1×103。实验分2组：CFSE标记组和未标记组，每组35孔，每天相同时间每组各取5孔细胞，加入MTT溶液20μL,3℃培养箱孵育h后用全自动酶标仪在