三种赤潮藻多克隆抗体制备

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1、孙宁波等：三种赤潮多克降抗体制备及特异性分析三种赤潮藻多克隆抗体制备及特异性分析*瑞典国际基金资助项目，IFS/grantSUIA/3864号。孙宁波，硕士，E-mail:sunningbo1221@hotmail.com。通讯作者：隋正红，教授，suizhengh@ouc.edu.cn。收稿日期：2007年１０月２５日。孙宁波隋正红包振民王春燕(中国海洋大学海洋生物遗传学与种质工程实验室,青岛266003)中国是全球受赤潮危害较重的国家之一（周名江等，2001），随着现代化工农业生产的迅猛发展，沿海地区人口的增多，大量工农业

2、废水和生活污水排人海洋，导致近年来赤潮的频繁发生和规模的不断扩大，严重破坏了渔业资源和海产养殖业，并威胁着人类的生命安全。中国海岸线较长，引起赤潮爆发的藻种种类多样，赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)、共生甲藻（Symbiodiniumsp）、链状亚历山大藻（Alexandriumcatenella）等藻种是常见的赤潮藻，危害较为严重，也是目前研究较多的主要赤潮藻，如何及时、精确、快速地对赤潮藻进定性、定量分析对于预报赤潮的发生、以及赤潮的检测研究均有重要意义和参考价值。传统的赤潮藻定性、定量鉴定主要是通过光

3、学显微镜方法(Hallegraeffetal.,1995)，此方法费时、费力，对一些个体微小的藻类难以做出准确鉴定（Rehnstam-holm,etal.,2002），因此发展新的检测技术成为赤潮研究的紧迫之需。Caron等(2003)用浮游金藻(Aureucoccus．anophagefferens)成功制备出高特异性的单克隆抗体与多抗血清，并对两者进行了多方面的特性分析。Nakanishi等(1996)利用单克隆抗体制作免疫传感器定量研究Chatonellmarina,可检测出100～10000ind/ml密度。向军俭等（

4、2003）制备了５种赤潮藻单克隆抗体，以抗体为基础的免疫检测方法克服了人为因素的影响，具有定性和定量的准确度。本文作者制备了３种不同粒径的赤潮藻-赤潮异弯藻、链状亚历山大藻、共生甲藻的多克隆抗体，采用间接酶联免疫法检测抗体的效价，采用竞争酶联免疫法检测多克隆抗体的特异性，为进一步的的开拓赤潮准确定性、定量检测提供依据，具有深远意义。一、材料与方法1.实验材料赤潮异弯藻、链状亚历山大藻和共生甲藻藻株均分离自青岛胶州湾海域。３种藻均采用f/2培养基（亓海刚等，2006）培养，温度为（20±1℃），光照强度为72μmol/m2·s，

5、采用14h：10h(L/D)的光暗周期，所用新西兰纯种兔由青岛市药检所提供。2.实验方法１）免疫原的制备将生长旺盛的藻细胞培养液用终浓度为2%的甲醛固定过夜，10000r/min，离心10min，收集藻细胞沉淀。藻细胞团块用蒸馏水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为10000r/min，离心10min。将收集的藻细胞分装于1.5ml试管中，甩去残余水分，-20℃保存备用。临用前取出，用灭菌的PBS重新悬浮均匀后方可使用。2）多克隆抗体制备7孙宁波等：三种赤潮多克降抗体制备及特异性分析开始免疫之前将处

6、理好的藻细胞用0.5mlPBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全。家兔通过四肢的腋下注射、背部皮下多点注射的方式进行免疫。初次免疫剂量分别为共生甲藻为1×107个、链状亚历山大藻1×107和2×105个和赤潮异弯藻1×107个细胞，加强免疫过程中，除佐剂换为弗氏不完全佐剂和免疫剂量减半外，其它步骤不变。免疫原为等体积的PBS藻细胞悬液和弗氏佐剂的混合物，每间隔十天加强免疫一次，共注射80d。利用肥达氏反应测得两种抗体的效价后，放血，收集血液，4℃静置血块收缩,2000r/min，离心5min,　提取血

7、清，-20℃保存备用。3）封闭吸附处理取赤潮异弯藻抗血清100μl，加900μl无菌PBS稀释，依次与108个塔玛亚历山大藻、108个共生甲藻的细胞混合，放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min,离心10min，收集上清，保存备用；按照类似的方法，换用共生甲藻的抗血清与108个塔玛亚历山大藻、108个赤潮异弯藻的细胞混合放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用;换用链状亚历山大藻的抗血清与108个赤潮异弯藻、108个共生甲藻的

8、细胞混合放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用。4）抗血清效价的测定抗血清效价的测定主要采用间接酶联免疫法（（亓海刚等，2006）。海藻或海藻粗提液包被(105~106ind/m1)，100μl/孔，4℃湿