汉坦病毒vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

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1、汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选【摘要】目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代，比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Vero细胞灭活疫苗，研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达700～775LgCCID50/ml和1∶320～1∶128

2、0；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达650～750LgCID50/ml和1∶160～1∶768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株ZJ4与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1∶10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。【关键词】汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)是一种严重危害人体健康的自然疫源性疾病。在各种预防HFRS的措施中，疫苗是一种最特异和最有效

3、的预防手段。迄今为止，本实验室已经研究出HFRSⅠ型、Ⅱ型和双价及双价纯化沙鼠肾灭活疫苗并已投入规模生产。经现场流行病学调查，疫区人群的保护率在95%以上，为预防HFRS起到了重要的作用〔1，2〕。但疫苗的毒种Z10野鼠型(HTN)和Z37家鼠型(SEO)均为20世纪80年代分离，距今已将近20年，随着时间的推移，HFRS的流行及临床症状有较大的变化，这预示着引起该病的病毒有可能发生变异。因此，必须选择疫苗的后备毒株，一旦发生目前疫苗保护率不高或不能保护时，即可用后备毒株生产疫苗。2001～20

4、02年，我们从浙江省的HFRS疫区鼠肺中分离到了9株汉坦病毒，筛选出病毒滴度较高、抗原性较好的4株毒株〔3〕，再将4株毒株在Vero细胞中的增殖特性、抗原性和免疫原性进行研究，从中筛选出ZJ4与ZJ5毒株为汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗理想的候选毒株。现将筛选的过程及结果报道如下。1材料与方法11Vero和Vero-E6细胞均由中国药品生物制品检定所惠赠，经本室传代保存，Vero细胞使用代次不超过150代，Vero-E6使用代次为30～60代之间。12病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株由本室采

5、用20d龄左右沙鼠分离自浙江省HFRS疫区捕获的野外鼠阳性鼠肺标本；76-118(HTN)和UR(SEO)株(中国药品生物制品检定所疫苗一室)。所有毒株使用前均经第四军医大学汉坦病毒单克隆抗体鉴定型特异性。其中对ZJ4、ZJ7毒株部分M片段核苷酸序列进行了测定，结果也证明属HTN型〔4〕。13动物出生20d左右的沙鼠和2～5d龄的乳沙鼠(系本实验室饲养)；家兔(浙江省药品检定所)，白毛，体重2～3kg，雌雄不限。14试剂HFRS荧光血清抗体和兔抗HFRSIgG致敏血球为本室自制。15汉坦病毒在乳

6、沙鼠脑内传代及病毒含量的测定将分离到的毒株接种1～5d龄的乳沙鼠，每只脑内002ml，15d左右收获，无菌取脑，用含10%小牛血清基础建立培养液(MEM)液制成鼠脑悬液，离心取上清，在Vero-E6细胞上测定病毒滴度以及利用反向被动血凝试验(RPHA)测定病毒抗原。需要传代的将脑悬液接种1～5d龄乳鼠，每只脑内002ml。16病毒在Vero细胞上的适应性传代分别将汉滩病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株鼠脑标本研磨制成10%的鼠脑悬液，离心后取上清液接种Vero细胞，进行适应性传代，培

7、养7d左右，取细胞刮片进行直接免疫荧光法(FA)〔5〕检查细胞感染情况，待感染量达+++～++++，将细胞瓶冻入-30℃冰箱，过夜后融化离心，取上清传代，连续传5代，每代取细胞冻融液少许，用来测定病毒和抗原滴度。17病变(CPE)观察将4株毒株感染长成单层的Vero细胞，37℃培养，每隔3d用含3%小牛血清的MEM换液1次，并逐日在倒置显微镜下观察细胞病变发展情况，连续观察12d。18敏感动物发病情况观察候选的4株毒株在Vero细胞上适应了5代后，将细胞冻融后离心的上清液(CP5)腹腔注射2～5

8、d龄的乳沙鼠，01ml/只，观察乳鼠的发病情况并记录发病或死亡时间。19FA法检测病毒滴度(LgCCID50/ml)用025%胰酶消化生长良好的Vero-E6细胞，以适应细胞浓度接种96孔微量培养板，每孔150μl，置37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长成单层，取待检毒种液，做10倍系列稀释，分别接种到E6单层细胞孔，接种量为10μl/孔，每个稀释度接种4种，置37℃、5%CO2条件下吸附2h，然后加3%小牛血清MEM的细胞培养液150μl/孔，再置37℃孵箱培养6～7d，用FA检查细胞感染病