实时荧光定量pcr在流感病毒核酸检测中的应用

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1、实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用蒋永林湖南省永州市疾病预防控制中心425000【摘要】目的:探究实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用价值。方法:选取2013年1月至2014年12月在我市采集的流感样病例咽拭子1624例用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸,分析检测的阳性率与阳性病例样木类型,总结流感流行趋势。结果:1624例咽拭子样木中流感病毒核酸呈阳性419例,阳性检出率为25.80%。阳性样木中甲型流感病毒H1N1亚型164例,占39.14%,甲型流感病毒H3亚型176例,占42.0%;乙型流感病毒7

2、9例,占18.85%。不同类型的流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义(P<0.05);结论:实时荧光定量PCR技术可迅速、准确的检测流感病毒核酸,有助于分析流感病毒的类型与流行趋势,为预防流感发牛.提供参考依据。【关键词】实时焚光定量PCR;流感;病毒核酸;检测流行性感冒[1-3](简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,临床表现为起病急、高热、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉疼痛等症状。流感潜伏期短,传播迅速,病毒抗原易变异,人群对变异株普遍易感。2009年甲型H1N1流感自墨丙哥爆发后迅速蔓延全球,引发了人们对流感的

3、恐慌,同时也引起了人们对预防流感的重视[4]。为有效预防流感的流行,加强对流感病毒的快速检测能力,木文研究了实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用效果,现将报道如下。1资料与方法1.1一般资料选取2013年1月至2014年12月在我市收集的流感样病例的咽拭子共1624例。所有咽拭子均是擦拭疑似流感患者的双侧咽扁桃体或咽后壁。咽拭子采集后置于含4.0ml的Hank′s液中,暂时于4.0°C冰箱中保存,并于24小时内送至实验室。实验室收到样本后先在旋窝震荡器上震荡5秒钟并取出拭子,编好号后置负70.0°C冰箱中

4、保存。1.2试剂与设备核酸提取试剂盒为ViralRNA/DNAMiniKit(美国Invitrogen公司);荧光定量检测试剂盒为:甲型流感病毒核酸测定试剂盒(荧光PCR法)、乙型流感病毒核酸测定试剂盒(荧光PCR法)、甲型H1N1流感病毒核酸测定试剂盒(荧光PCR法)、甲型流感病毒H3亚型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)(上海之江生物科技有限公司);焚光定量PCR仪(美国AB公司)、低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。1.3研究方法样本核酸提取按试剂盒ViralRNA/DNAMiniKit说明书进行。PCR检测反应体系

5、总体积为25.0ul:取检测混合液19.0ul,加酶混合液l.Oul(内含逆转录酶和Taq酶),最后加入5.0ul待测样本核酸提取液,震荡混匀并短暂离心后上机检测。PCR反应条件为:45.0°C,lOmin,95.0°C,15min;95.0°C,15sec,60.0°C,lmin,共40个循环,单点荧光检测在60.0°C吋进行。1.4观察指标统计采用实吋荧光定量PCR技术检测流感病毒的阳性率,并分析阳性样本的类型。1.5统计学方法采用SPSS18.0统计学分析软件进行数据处理,计数资料采用百分数表示,组间比较采用χ2检

6、验,以P<0.05作为差异具冇统计学意义的标准。2结果2.1PCR检测结果分析表1流感病毒核酸PCR检测结果本研宄采集的1624例咽拭子样本经实吋荧光定量PCR技术检测后共证实流感病毒核酸呈阳性419例,阳性检出率为25.80%。阳性样本中甲型流感病毒H1N1亚型164例,占39.14%;甲型流感病毒H3亚型176例,占42.0%;乙型流感病毒79例,占18.85%。不冋类型的流感病毒阳性检出率差异具奋统计学意义(P<0.05)o详见表1。3讨论流行性感冒是急性呼吸系统常见疾病,主要是由流感病毒引起的,具奋感染性强、

7、潜伏期短、病情发展迅速等特点,患者临床表现多为高热、乏力、呼吸系统疾病症状等,严重威胁人类生命健康[7,8】。相关研究表明[9],流感病毒致病率高,而且随着药物广泛治疗,病毒的变异性逐渐提高。为了降低发生大范围的流感病毒感染的风险,必须加强对流感病毒的预防[10】。实时荧光PCR检测技术是利用PCR反应体系中加入荧光基因,并利用荧光信号实吋积累并监测整个PCR反应进程,最后利用标准曲线对检测B标物进行定量分析,是临床上用于病毒核酸定量检测的常用方法。因此,笔者研究采用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸的应用效果,旨在为临床应用提

8、供参考。本研宄通过对1624例疑似流感患者咽拭子样本进行实吋荧光定量PCR技术检测,共检测出甲型流感病毒H1N1亚型164例,占39.14%;甲型流感病毒H3亚型176例,占42.00%;乙型流感病毒79例,占18.85%。研究结果提示实吋荧光定量PCR技术对甲

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