解淀粉芽孢杆菌y

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　　解淀粉芽孢杆菌Y第一章文献综述1.1细菌素的分类羊毛硫细菌素是一类在自身核糖体合成，经翻译后修饰形成具有特殊氨基酸的环状多肽。这类细菌素由19-50个氨基酸残基组成，分子量一般小于5kD。因其含有羊毛硫氨酸（lanthionine，Lan）等特殊氨基酸而得名。一般由革兰氏阳性菌产生，包含葡萄球菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、链球菌属、链霉菌属、微球菌属、肠球菌属以及乳杆菌属等[5]。其中乳酸链球菌素（Nisin）是这一类的代表，一般由乳酸链球菌分泌产生的一类小分子多肽化合物，其作为食品防腐剂已有60多年的应用历史，较化学合成防腐剂（对羟基苯甲酸类、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐）相比，乳酸链球菌素具有热稳定性好、抗菌性强、安全无毒、作用范围广、水溶性好等合成防腐剂无法比拟的优点，另外，一些羊毛硫细菌素由于杀菌方式独特，不易产生耐药性且作用浓度较低，已处临床试验阶段或已被批准作为药品[6]。β-甲基脱氢丙氨酸（Dehydrobutyrine，Dhb）和脱氢丙氨酸（Dehydroalanine，Dha）。特殊氨基酸的形成过程如下:首先核糖体合成的前肽分子中苏氨酸或丝氨酸在修饰酶的作用下脱去一分子水，形成Dha或Dhb，然后其与分子中的半胱氨酸发生加成反应，形成硫醚键即为MeLan或Lan。其生物合成过程如下：首先结构基因编码的前肽LanA（包括原肽和前导肽两部分）被合成，依靠其前导肽的作用，修饰酶LanB和LanC或双功能的LanM对原肽序列的苏氨酸或苏氨酸进行脱水，然后与分子内的半胱氨酸的自由巯基发生加成反应而形成硫醚键，修饰后的LanA被加工转运蛋白LanT转运至胞外并切除或由蛋白LanP酶切前导肽，形成具有生物活性的成熟肽；成熟肽产生大多受基因簇上的双组份调控系统LanK/LanP调控，同时LanE、LanF、LanG等蛋白对成熟肽产生免疫作用，防止对自身造成伤害[7]。..1.2细菌素的作用机制普遍认为细菌素的作用分为两个步骤：首先是以非特异性或特异性的细胞为靶向物，专一性地吸附到易感细胞表面的受体上，然后再发挥其杀菌作用。大部分乳酸菌细菌素似乎表现为一种共同的作用方式，即通过在细胞膜上形成孔洞释放出胞内的离子（如K十），从而造成电子传递体的解偶联，引起质子泵的丧失，影响某些物质的运输和ATP的合成，影响能量代谢及阻断 RNA、蛋白质、DNA等大分子物质的合成等，最终引起细胞的死亡[16]。目前认为lantibiotic型细菌素的靶细胞侵入细胞膜内形成通透孔道，可允许分子量为0.5kDa的亲水性溶液通过，导致细胞膜去极化及ATP外泄，细胞外水分子流入，K+离子从胞浆中流出，细胞自溶而死亡。因其作用需膜电位的存在，通过在膜上形成通道，降低pH梯度和膜电位，导致细胞内溶物外泄而抑菌，故又称此类细菌素为能量依赖型细菌素[17]。非lantibiotic型的细菌素同样也是在细胞膜上形成一个亲水通道，但是这个亲水通道是经细胞膜上特定的受体蛋白自导的，与膜电位存在与否无关，故称此类细菌素为非能量依赖型细菌素[18]。与lantihiofic型相比，此型细菌素的作用是破坏细胞膜功能的稳定性（如能量传导），而不是破坏膜结构的完整性。其中细菌素对芽孢的作用机理研究了解得甚少，目前所知的大部分都是关于乳酸链球菌素方面的研究。乳酸链球菌素可以起到抑制芽孢而非杀死芽孢的作用，它可以阻断肉毒梭菌（C.botulinum）芽孢前期至出芽孢之阳撇过程。其机理也许在于乳酸链球菌素可以修饰己萌发的芽孢的胞膜的巯基，也许是由于乳酸链球菌素的疏水残基可起到电子受体的作用。第二章高产细菌素菌株的筛选、鉴定及其所产细菌素性质的初步研究2.1实验材料2.1.1菌株本实验室从烟台黄曲霉污染严重的不同地区的44个土壤样品中分离得到94株细菌2.1.2供试指示菌株金黄色葡萄球菌本实验室保藏大肠杆菌本实验室保藏白色念珠菌本实验室保藏2.1.3实验仪器S)..........624.4结果与分析..........624.5本章小结.......674.4结果与分析 洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/1/1；v/v/v）为1-10，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/3/1；v/v/v）为11-30，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/8/1；v/v/v）为31-38，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/13/1；v/v/v）为39-45，洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/30/1；v/v/v）为46-54。由图4-2可知，11-30抑菌活性最好，因此洗脱液三氯甲烷/甲醇/乙酸（100/3/1；v/v/v）能够把目标产物得到纯化。将ESI-MS为500-700局部放大得到图4.4，对其中ESI-MS的峰值分析表明：碎片中有许多氨基酸残基，如：Val、Glu、Thr。因此，初步鉴定该物质为脂肽类的细菌素。由于产物纯度和质量不够，因此，还不能确定出目标物质的具体结构和分子量。据报道，芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质，Peypoux等[93]从枯草芽孢杆菌中分离得到Iturin，Vanittanakom等[94]从枯草芽孢杆菌中分离纯化得到Fengycin。它们大多为低分子量脂肽类物质。本文所分离的物质与前人相比在性质方面有所差别：Fengycin不溶于水，而本文的活性物质却有很好的水溶性，下一步的计划是对其结构进行更深入的研究，相应机理方面的工作也正在准备之中。结论1、从烟台黄曲霉污染严重的不同地区的44个土样中分离到的94株细菌，初筛到43株具有不同程度的抑菌活性，从中选取一株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌都有抑菌活性的菌株，命名为Y-32-1。根据菌株Y-32-1的形态、生理生化特性和16SrDNA系统发育分析，将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）菌株Y-32-1所产细菌素具有很好的耐酸碱性，发酵上清液抑菌活性的pH值为1-13。该细菌素对热很稳定，沸水浴1.5h抑菌活性没有明显变化，100℃、2h的热处理下活性降低到原来的70%。该细菌素对胰蛋白酶不敏感，对脂肪酶敏感，因此，可以推断该细菌素中可能含有酯键。2、在单因素实验的基础上，对发酵条件进行Plackett-Burman实验，确定玉米浆浓度、培养温度和培养基起始pH值为影响发酵液的抑菌活性的主要因素。设计爬坡实验得到最佳实验中心点，通过响应面分析法对这三个因素进行了研究，最终确定最佳培养条件为：种龄为20h、接种量5%、装液量70mL/250mL、温度31.6℃、初始pH值7.2、摇床转速120r/min。最佳发酵培养基条件为：玉米浆31.7g/L、蔗糖糖蜜2.0g/L、氯化钠6g/L、磷酸二氢钾 5g/L、磷酸氢二钠5g/L。优化后细菌素的抑菌圈直径24.6667mm，比优化前相比，细菌素的抑菌圈直径提高了12.16%。3、本实验对菌株Y-32-1产生的抗菌活性物质进行了分离纯化并对其抑菌活性进行了相应的研究。在纯化过程中通过有机溶剂萃取、盐酸沉淀和柱层析的手段达到了分离纯化的目的。该物质易溶于水、极性有机溶剂，具有一定的亲水性。通过质谱推测该物质为肽类。