农杆菌介导氮高效利用转基因水稻植株获得

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1、农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得摘要：将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ｎａｔ３通过农杆菌介导的遗传转化方法，转入水稻品种中花１１，在含３０ｍｇ／ｌbａｓｔａ的选择培养基上筛选，获得４５６棵抗性植株，对ｎａｔ３目标基因检测，获得３１３棵阳性植株，初步证明目标基因已整合到中花１１基因组中。关键词：转基因水稻；硝酸盐转运蛋白；氮高效利用transgenichighnuseefficiencyriceobtainedbyagrobacteriumtumefaciensｚｈａｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ｗａｎｂｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ｙｉｎｄｅ－ｓｕｏ，ｄｕｘｕｅ－ｓｈｕ

2、，ｑｉｈｕａ－ｘｉｏｎｇ（ｆｏｏｄｃｒｏｐｓｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｈｕｂｅｉａｃａｄｅｍｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｕｈａｎ４３００６４，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｎａｔ３ｇｅｎｅｃｏｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｈｉｇｈｎｉｔｒａｔｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓｗａｓｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｉｎｔｏｒｉｃｅ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’ｖｉａａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．４５６ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｏｂ

3、ｔａｉｎｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ３０ｍｇ／ｌｂａｓｔａ．３１３ｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｇａｉｎｅｄｂｙｐｃｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｔａｒｇｅｔｉｎｇａｔｎａｔ３ｇｅｎｅ．ｉｔｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｎａｔ３ｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：transgenicｒｉｃｅ；ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ｈｉｇｈｎｕｓｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［１］

4、。硝酸盐（ｎｏ３－）是植物主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的因素［２－４］。但过量硝酸盐如果没有被植物吸收，极易通过淋失、渗透等途径转移到水环境中，造成水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人体健康产生极为不利的影响［５］。氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率有影响，采用氮素运筹可影响免耕移植水稻产量及氮素利用率［6，7］。因此，提高氮肥的利用效率，对于促进氮肥的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。水稻是最早通过基因工程手段进行品种改良的作物之一，我国的转基因生物新品种培育重大专项也已实施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的转基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此

5、迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的转基因水稻新种质。该研究通过农杆菌介导的遗传转化方法，将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ｎａｔ３导入中花１１中，旨在培育氮肥高效利用的转基因水稻，减少氮肥施用量，节约水稻生产成本，从而降低环境污染，促进农业高效节能、可持续发展。１材料与方法１．１材料用于研究的水稻材料为中花１１，植物表达载体由中国农业科学院生物技术所刘昱辉博士惠赠，根癌农杆菌菌株为ｅｈａ１０５。１．２方法1.2.1水稻胚性愈伤组织的获得将成熟种子剥壳后放在５０或１００ｍｌ三角瓶中进行常规消毒，接种于诱导培养基中，每皿约３５～４０粒，封口膜封好后于２８℃

6、暗培养。１．2.2农杆菌介导的遗传转化农杆菌在ｌａ培养基上２８℃培养2d后，用药勺刮取少量菌斑悬浮于含有１００μｍｏｌ／ｌ的乙酰丁香酮的ｌｂ培养基，调整菌液浓度至ｏｄ６００nm＝０．６左右。将经过预培养的水稻成熟胚诱导的胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中，略微摇动后静置５ｍｉｎ，然后将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，在超净工作台中吹干。最后将愈伤组织转入添加有１００μｍｏｌ／ｌ的乙酰丁香酮的共培养基上，１８℃暗培养３ｄ。１．2.3抗性愈伤组织的筛选待愈伤组织共培养２～３ｄ，取出愈伤组织，用无菌水冲洗３～５次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。然后用含２５０ｍｇ／ｌ羧苄青霉素的无菌水再清洗一

7、遍，置于无菌滤纸上吹干后，转移至选择培养基（添加２５０ｍｇ／ｌ羧苄青霉素以及３０ｍｇ／ｌbａｓｔａ）筛选抗性愈伤组织。每两周将愈伤组织转移至新选择培养基上，约需３次继代培养获得抗性愈伤组织。１．2.4抗性植株的获得将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行分化培育，每一瓶中可放置３～４块不同克隆的愈伤组织。１周后愈伤组织开始转绿，３周后幼苗长到５ｃｍ时，可进行生根培养。１．2.5转基因植株的ｐｃｒ检测ｃｔａｂ法提取水稻总ｄｎａ。ｐｃｒ扩增