小鼠白细胞介素

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1、小鼠白细胞介素周强，周巧梅，李云，庞庆丰，曾因明【摘要】目的在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因。方法用NsiⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A（nisA）启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中.freelaninterleukin-12，rhIL-12）的临床试验提示rhIL-12在治疗肿瘤、病毒感染性疾病及哮喘中具有肯定的效果。国内、外均采用基因工程的技术使用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法在COS-7细胞、肝癌细胞

2、株中进行体外表达得到rhIL-12［6-7］。但存在着成本昂贵、操作技术复杂、表达量较低、需多次提取纯化才能使用等缺点。而如果将携带rhIL-12的逆转录病毒或重组腺病毒载体静脉注射或局部注射使rhIL-12在体内表达，则存在的主要问题是:转移效率低，免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达［8-9］。因此寻找一种简便而又实用的开发rhIL-12的方法使其尽快成为一个新的药物非常重要。近年来，人们在研究乳酸菌的过程中所建立的乳酸菌基因表达系统为有效地开发和利用rhIL-12提供了新的机遇。本研究报道了小鼠IL-12基因在食品级微生物乳酸乳球菌中的活性表

3、达，从而为以乳酸乳球菌为基础的IL-12应用研究提供依据。1材料和方法1.1质粒、菌株及培养条件乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）NZ9000和pSEC-E7质粒为法国农业科学院Luis教授赠送，大肠杆菌DH5α、pGEM-IL-12载体为本实验室保存；其中大肠杆菌DH5α用于质粒pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重组表达质粒pSEC-IL-12的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素使用浓度为100mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为1

4、0mg/L、乳酸乳球菌为5mg/L。IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海森雄公司。1.2重组质粒的构建及转化重组质粒构建如下：用NsiⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有nisA启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒，pSEC-IL-12质粒含有Usp45信号肽。乳酸乳球菌转化采用电穿孔转化法，电穿孔仪为美国Bio-Rad公司，脉冲参数为1.25kV/mm，25μF和200Ω。重组质粒经电击转化乳酸乳球菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳

5、球菌中提取质粒pSEC-IL-12，进行电泳鉴定。1.3小鼠HO-1基因在乳酸乳球菌中的诱导表达含重组质粒pSEC-IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30℃静置培养过夜,用新鲜培养基1∶50稀释，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导物Nisin至终浓度10mg/L，继续培养3h。终止培养后，取2ml培养菌液，4℃、8000r/min离心5min，上清液浓缩50倍后经15％SDS-PAGE电泳分离后，通过Bio-Rad印迹仪转移至硝酸纤维素膜上作arker的对照下，条带处于同一位置高度，说明转化是成功的。2.2IL-12蛋白质的

6、表达在Nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌rmIL-12约80ng/L（见图3），和野生菌比较，oonkaDK，HenzelBS，etal.Apilottrialofrebinantinterleukin-12inpatientsentJGastroenterol，2001，96(8):2473-2479.［2］OhnoR，YamaguchiY，TogeT，etal.Adose-escalationandpharmacokiicstudyofsubcutaneouslyadministeredrebinanthumaninterleukin1

7、2anditsbiologicaleffectsinJapanesepatientsalignancies［J］.ClinCancerRes，2000，6(7)：2661-2669.［3］JacobsonMA，HardyD，ConnickE，etal.Phase1trialofasingledoseofrebinanthumaninterleukin-12inhumanimmunodeficiencyvirus-infectedpatientsicroL［J］.JInfectDis，2000，182(4)：1070-1076.［4］BryanSA，O’

8、ConnorBJ，MattiS，etal.Effectsofrebinanthumaninte