血清浓度对tgf

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1、血清浓度对TGF刘苹,李平,周元国,雷英【摘要】目的比较低血清浓度(0.4%)和正常血清浓度(10%)培养条件对TGF-β1刺激成纤维细胞增殖的影响。方法原代大鼠皮肤成纤维细胞分别采用0.4%和10%血清浓度培养，加TGF-β1刺激细胞后，分别用BrdUELISA法检测细胞增殖情况，噻唑蓝(MTT)比色法制作细胞生长曲线。结果0.4%和10%血清浓度下，250pg/mlTGF-β1均促进成纤维细胞增殖(P＜0.01)，并促使生长曲线的峰值提前和增加。而25ng/mlTGF-β1均抑制成纤维细胞增

2、殖(Ｐ＜0.05)，并导致生长曲线峰值的滞后和降低。结论血清浓度对大小剂量TGF-β1刺激成纤维细胞增殖变化无明显影响。【关键词】血清；TGF-β1；细胞增殖；MTT法；BrdUELISA法ABSTRACTObjectiveToparetheeffectsbet)(0.4%)andhigh-concentratedFBS(10%)onfibroblastproliferationinducedbyTGF-β1(transforminggroarydermalfibroblastsofratsed

3、iumrespectively;afterTGF-β1ethodadeoutcellgrolTGF-β1promotedcellproliferation(Ｐ＜0.01),thepeakofthecellgrolTGF-β1inhibitedcellproliferation(Ｐ＜0.05),andledtoalaterappearanceofthepeakofthecellgrotransforminggroethod皮肤成纤维细胞是重要的修复细胞之一，具有增殖、分泌、分化等多项功能.free

4、linggrolTGF-β1刺激成纤维细胞增殖，而25ng/ml抑制增殖［4］，但当时采用低血清(0.4%)培养条件。为了探讨正常血清浓度对TGF-β1刺激成纤维细胞增殖是否存在影响，我们通过BrdUELISA法和MTT法对低血清浓度(0.4%)和正常血清浓度(10%)培养条件下TGF-β1刺激成纤维细胞的增殖情况和生长曲线进行了观察。1材料和方法1．1材料和试剂健康EM培养基（Hycolone,美国）：加入NaHCO3、Hepes、青霉素、链霉素，调pH7.2～7.4；FetalBovineS

5、erum（胎牛血清，Sigma，美国）；0.25％胰蛋白酶(Sigma，美国)；TGF-β-1（PeproTech，美国）；MTT(美国Sigma公司)；BrdUELISA试剂盒(5-溴脱氧尿嘧啶核苷Bromodeoxyuridine，Roch，美国)；多功能荧光读板机(Bio-tak，美国)。1．2原代大鼠皮肤成纤维细胞培养和鉴定［5］采用组织块贴壁法原代培养成纤维细胞，I型胶原抗体免疫组化方法鉴定成纤维细胞，EM，置于CO2孵箱培养。细胞长满后，胰蛋白酶消化传代，取3～5代细胞进行实验。Ⅰ型

6、胶原抗体免疫组化方法鉴定成纤维细胞。400×光镜下观察，阳性结果为胞浆内有棕黄色颗粒。1．3BrdUELISA法检测0.4%和10%血清浓度下TGF-β1刺激成纤维细胞的增殖情况，实验共分0.4%血清-250pg/mlTGF-β1组，0.4%血清-25ng/mlTGF-β1组，0.4%血清对照组，10%血清-250pg/mlTGF-β1组，10%血清-25ng/mlTGF-β组，10%血清对照组。以细胞数4×103个/孔接种于96孔板，次日加入无血清培养基同步化细胞48小时，再加入0.4%和10

7、%浓度的血清，以及250pg/ml和25ng/mlTGF-β1。48小时后用BrdUELISA试剂盒检测细胞增殖情况。每个实验组4个复孔，重复实验三次。1．4MTT法检测0.4%和10%血清浓度下TGF-β1刺激成纤维细胞的生长曲线，实验分组同上。以细胞数2×103个/孔接种于96孔板，次日加入相应血清浓度的DMEM，再分别加入250pg/ml和25ng/mlTGF-β1。每3天以相应浓度血清和TGF-β1换液1次。自接种次日至第8日每天取每组4孔细胞进行MTT检测。以时间为横坐标，吸光值为纵坐

8、标作细胞生长曲线。1．5统计分析所有数据均以平均数±标准误(±SE)表示，采用MicrosoftExcel统计软件系统进行分析。每两组之间的资料比较采用双尾Student’st检验，Ｐ＜0.05为差异显著，Ｐ＜0.01为差异非常显著。2结果2．1原代皮肤成纤维细胞培养及鉴定组织块接种3～5天，倒置显微镜下可见有梭形细胞爬行游出，约7～9天，细胞汇合成片，经2次传代后，几乎为纯净的成纤维细胞(图1、A)。免疫组化鉴定细胞Ⅰ型胶原染色为阳性(图1、B)，表明原代培养成纤维细胞成功。2．2BrdUEL