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1、清毒栓对宫颈癌SiHa细胞及PTEN.freelthelevelofcellbiologyandmolecularbiology.MethodsSiHacells.Normalcontrolgroup,blankserumgroup,Qingdushuangroup,Baofukanggroupandinterferongroupethod.ResultsAftercultured,thenumberofcellsdecreased,4%concentrationofserumfor72hetime,drugc
2、ontainingserumelevatedexpressionoftumorsuppressorproteinofPTENandp53,reducedcancerproteinexpressionofMDM2.ConclusionQingdushuancontainingserumcaninhibittumorthroughregulatingPTEN-MDM2-p53L药液,终浓度约为4.2g/mL,高温消毒后于4℃冰箱保存。中药阳性对照药按保妇康栓组成比例(主要成分为莪术油及冰片)制成口服溶液。安达芬注射
3、用重组人干扰素α-2b,安徽安科生物工程股份有限公司生产)。以上药物均按人临床给药剂量的等效剂量10倍制成药物留用(200g体重大鼠给药剂量＝60kg体重人给药剂量×0.018×10)。2实验方法2.1分组及给药将大鼠随机分成4组：空白血清组给生理盐水、阳性药组(清毒栓组)、中药对照药组(保妇康组)、西药对照药组(安达芬组),每组10只。每日同一时间给空白血清组、消毒栓组、保妇康组灌胃,安达芬组用注射用水溶解后按比例给予肌注,隔日1次,6d后腹主动脉取血。将血液静置30min后,3000r/min离心10min
4、,取上清分装到1mL无菌EP管中,保存至-86℃冰箱备用,用前56℃水浴30min灭活补体。2.2MTT法测定含药血清对SiHa细胞的抑制作用取对数生长期细胞制成单细胞悬液,计数,细胞浓度为3×104个细胞/mL,每孔100μL,接种于96孔培养板中,设空白调零孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h后,用含2.5%胎牛血清的培养基分别稀释含药血清浓度为4%、8%,终体积为100μL/孔。每种浓度设立6个平等对照孔,并设正常对照,置正常培养条件下培养。每24h换液1次,作用24、48、72h后,弃去孔中培养液
5、,每孔加入MTT100μL,反应4h后,弃去每孔中的液体,加入DMSO,100μL/孔,振荡10min后,选择492nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值,记录结果。2.3DM2、p53的含量用细胞刮子分别收集以4%浓度不同含药血清培养液作用72h及对照组细胞的蛋白,冰浴1h,然后4℃离心10min。将上清移至预冷的EP管中,Bradford法测定蛋白含量后,将剩余蛋白样品加入等体积上样缓冲液,沸水中煮5min。制胶后上样,以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。分别将处理好的80μg各组蛋白样品按照预定的顺序加入浓
6、缩胶的上样孔内。经过电泳及转膜、封闭,将膜移入杂交袋中,加入用适当漂洗液稀释的一抗(PTEN为1︰200,p53为1︰200,MDM2为1︰250),封口,4℃孵育过夜,加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(PTEN为1︰2000,p53为1︰5000,MDM2为1︰2000),振荡温育后感光、拍照。用BandLeader3.0软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。3统计学方法采用SPSS12.0软件包进行统计学处理,数据以x±s表示,采用方差分析。4结果(见表1、表2、图1)表14%含药血清作用不同时间S
7、iHa细胞生长及增殖情况(略)、注：与空白血清组同期比较,*P＜0.01表24%含药血清作用72h后各组PTEN、MDM2、p53蛋白表达比较(略)注：与空白血清组比较,△P＜0.01,▲P＜0.055讨论PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因,有研究表明,该基因表达缺失与宫颈癌的恶性演变、浸润生长及远处转移有关。PTEN主要通过脂质磷酸酶活性发挥抑癌作用,该基因的编码产物能够使被PI3K激活的细胞内第二信使PIP3去磷酸化,从而影响细胞内PI3K/Akt信号转导途径2。MDM2基因是一原癌基因,近年来研究表明,P
8、I3K/Akt信号转导途径可以激活细胞的磷酸化过程,从而导致MDM2癌蛋白由胞浆进入胞核,而PTEN对该信号转导途径的影响可以阻止MDM2蛋白由胞浆进入胞核,从而加速该蛋白的降解2-3。p53基因是抑癌基因,MDM2高表达呈现癌基因的功能,其表达产物在细胞核内可以与野生型和突变型p53结合使其功能失活。MDM2在体内与p53构成降解-反式激活循环通路,是p53蛋白最重要的负调控因子。一
