利用烟草和豌豆瞬时表达抗afgf单链抗体

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1、利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体第一章前言1.单链抗体的研究进展抗体（antibody，Ab）是动物免疫系统受到抗原刺激后，由B淋巴细胞或浆细胞分泌合成的一类能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。抗体是动物最重要的免疫系统组成部分之一。所有的抗体都具有共同的4条多肽链结构：两条完全相同的重链（H）和两条完全相同的轻链（L），通过二硫键连接在一起[16]。4条多肽链在羧基和氨基的末端分别包括恒定区（C）和可变区（V），重链（H）和轻链（L）的可变区通过它们的第一个恒定区（C）结合在一起，形成两个完成相

2、同的抗原结合位点（Fab）。抗体的效应功能，如抗原依赖的细胞毒素是由可结晶区（Fc）结构调解的[17]。最近，植物生物反应器在药用蛋白表达的研究上取得了长足的进展。植物系统能够有效对重组蛋白进行准确的合成、加工，维持正确的蛋白构象，保证生物学功能不受影响。利用植物生产的药用蛋白生产成本低，易于纯化，且表达策略灵活多样，与原核表达系统相比具有极大的优势和广阔的应用前景。尤其是基于植物病毒载体的瞬时表达系统，具有表达周期短，蛋白表达量高等优点，极有希望成为价值蛋白的主要及生产方法[13-15]。基于此，本研究在实验室前期工作的基础上，开展了抗aF

3、GF单链抗体在植物中瞬时表达的研究工作，期望建立一种安全、高效、易于规模化生产的单链抗体瞬时表达系统，为小分子抗体药物科学研究及规模化生产奠定实验基础。1.2抗体的几个发展阶段自1890年，Kitasato等[18]第一次描述抗白喉和破伤风毒素抗体的免疫活性以来，大量的科学家把研究兴趣集中在对抗体的结构和功能探索的研究上。1975年，Khler和Milstein发展了杂交瘤技术[19]，制备了专化性更强的单克隆抗体（mAbs）。据不完全统计，目前已有36种治疗型单克隆抗体在欧盟被核准。单克隆抗体与相应抗原具有高度的特异性及极强的结合能力，能够

4、选择性消除肿瘤细胞并且维持一定的细胞毒性，为肿瘤治疗开辟了一条新的途径。近年来，单克隆抗体药物在肿瘤靶向治疗上的应用得到迅速发展，在肿瘤临床治疗上发挥越来越重要的作用。但是，在发展的同时也存在一些问题与不足：目前采用的单克隆抗体多是鼠源性，当用于人体极易引起人抗鼠抗体(HAMA)反应，伴随强烈的致敏反应，产生一定的毒副作用[20]；另外，由于肿瘤的间质内压要高于正常组织，单克隆抗体又多是生物大分子，无法在肿瘤靶向部位大量摄取，降低了单克隆抗体对肿瘤的抑制作用[21]。为了解决单克隆抗体存在的问题，人们对抗体分子进行了改造和修饰，产生了第三代抗

5、体基因工程抗体。其中，单链抗体（scFv）作为基因工程抗体的重要发展方向，具有单克隆抗体无法比拟的优势，受到人们的广泛关注[22-26]。..第二章抗aFGF单链抗体在烟草和豌豆中的瞬时表达1.材料与方法1.1实验材料1.1.1植物材料野生型烟草（Nicotianabenthamiana）种子，由英国Sainsbury实验室Baulb博士惠赠；豌豆种子购自吉林省农业高新技术研究开发有限公司。1.1.2菌种和质粒农杆菌菌株：EHA105和GV3101均由本实验室保存。EHA105选择标记为利福平抗性，GV3101选择标记为利福平和四环素抗性（带

6、有一个伴随因子质粒pJICSA_Rep）。大肠杆菌菌株：DH5α由本实验室保存，用于阳性克隆的筛选和质粒的保存、扩增实验。pET-28a-scFv质粒：由本实验室保存，scFv目的片段长度为741bp。p35S-30B-GFP质粒：由中科院微生物研究所方荣祥教授实验室惠赠。该载体将烟草花叶病毒（TMV）30B的cDNA序列置于35S启动子和NOS终止子之间，再将整个病毒cDNA表达框克隆到pCambia1300载体中，构建成p35S-30B载体。为了便于基因表达观察，在30B载体病毒移动蛋白的下游引入GFP（绿色荧光蛋白）报告基因

7、，构成p35S-30B-GFP载体，选择标记是卡那霉素抗性。p35S-30B-scFv质粒：由本实验室构建、保存，是以p35S-30B载体为骨架构建而成。在scFv基因的5端引入PacI酶切位点和6个组氨酸序，3端引入KDEL序列和XhoI酶切位点，长度约850bp。pCAPE1和pCAPE2-GFP质粒：由丹麦农科院Constantin博士惠赠。PEBV病毒是一种双链RNA病毒，包括RNA1和RNA2两条链。其中RNA1链编码与病毒复制和运动有关的蛋白，RNA2链编码衣壳蛋白。该载体将PEBV病毒RNA1和RNA2链的cDNA序列分别插入到

8、pCambia1300载体的左右边界之间，转录元件被35S启动子和NOS终止子控制。pCAPE1包含PEBV病毒RNA1链的全长cDNA序列，为了保证质粒在细菌中的