多糖结构解析

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1、多糖（Polysaccharide）是天然大分子物质，是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分析较蛋白质结构分析复杂，一方面是因为组成多糖的单糖品种繁多（目前已知的单糖有200多种）；另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有分枝（蛋白质没有分枝），所以多糖的结构种类就很多，不容易分析。多糖结构测定的意义从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即使具有很强的活性与具有较大的安全性，但如果结构不清楚，则无法进一步开展其药理学与毒理学研究，也就不可能进行人工合成或结构修饰改造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究，其学术及应用价值将会大大降低。结构研究的主要程序(1)初步推断化

2、合物类型1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的溶解度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。3结合文献调研。(2)测定分子式,计算不饱和度1、元素定量分析2、分子量测定3、同位素峰法4、HI–MS等(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结构分析）1、官能团的定性及定量2、测定并解析化合物的有关光谱（UV,IR,MS,HNMR,CNMR等）(4)推断并确定分子的平面结构1、结合文献调研2、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。(5)推断并确定分子的主体结构1、测定CD或ORD谱2、测定NOE,NOESY或ZD-NMR谱3、进行X射线晶体衍

3、射分析或人工合成一、组成成分分析1、酸水解1-3N硫酸，100℃，水解6-8小时。用碳酸钡中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。气相色谱分析纸层析（PG）：展开剂：正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5；正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3显色剂：常用硝酸银显色剂A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V）B：1%NaOH乙醇溶液（W/V）C：6mol/L氢氧化铵①喷试剂A，室温风干；②将纸浸入B液中，待斑点显色；③再浸入C中以洗去滤纸上的氧化银；④水冲洗1小时左右，风干，显棕黑色斑点。2、乙酰解冰醋酸溶液加入少许硫酸进行乙酰解，可以生成乙酰化单糖通过气相色谱鉴定。原因：因为1-6糖苷键多糖对酸水解相对稳定

4、一些，但在乙酰解中则优先断裂，有利于结构的研究。3、碱降解4、酶解二、糖与蛋白之间连接键型分析β-消除反应原理：糖温和条件下稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来。与天冬酰胺相连的N-型连键则不能被稀碱水解下来。所以，β-消除反应在糖蛋白的结构分析中，常被用来区别糖链的连接性质。方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在60℃水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比，在230-270nm范围内扫描。结果判断：在270nm处无明显吸收峰增加，提示：糖与蛋白之间的连接键属非O-型糖苷键。三、结构研究的化学方法完全酸水解阐明结

5、构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常用的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α型较β型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷键一般较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液，然后用层析方法分析，常用的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这种酸水解方法分析已经达到完全自动化。部分酸水解控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较低分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压液相层析。解析寡糖结构较多糖简

6、便的多，但需减少回复现象，水解时多糖的浓度小于5%。碱降解反应碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端的单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分析多糖碱降解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分子的非还原端。过碘酸及其盐的氧化反应多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似，其与过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二元醇相似，其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的（1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐

7、的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。1、过（高）碘酸氧化原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。结果：12或14键：每个糖基仅消耗一个分子的高碘酸，无甲酸释放。13位键：不被高碘酸氧化16位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一个分子甲酸。然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。防止发生超氧化：控制pH3-5；避光；空白对照实验1→、1→6键型以1→2位键合(1→2,